针对PLK1 polo-box结构域的新型高效肽抑制剂的发现：基于结构的药效团建模、虚拟筛选、分子对接、分子动力学研究及生物学评价

《Journal of Environmental Science and Health, Part B》：Identification of novel potent peptide inhibitors targeting the polo-box domain of PLK1: structure-based pharmacophore modelling, virtual screening, molecular docking, molecular dynamics study and biological evaluation

多发性骨髓瘤中PLK1过表达与不良预后相关，本研究通过结构虚拟筛选发现五个靶向PLK1-PBD的肽（PLs 1–5），其中PL-1结合常数最低（3.11±0.05 nM），对U266细胞抑制活性最强（IC50=0.09±0.01 μM），且具有高选择性和生物稳定性。

　　在医学研究领域，癌症已成为全球范围内最严峻的健康挑战之一。其中，多发性骨髓瘤（Multiple Myeloma）作为一种血液系统恶性肿瘤，其发病率持续上升，给患者带来了巨大的身体和心理负担。这种疾病通常由浆细胞的异常增殖引起，主要表现为骨髓中浆细胞的过度积累，导致骨质破坏、贫血、高钙血症以及肾功能障碍等临床症状。尽管目前已有多种非特异性治疗药物被批准用于多发性骨髓瘤的治疗，如烷化剂、糖皮质激素和蛋白酶体抑制剂等，但这些药物在治疗过程中往往伴随着严重的副作用，限制了其在临床应用中的广泛性。因此，开发针对特定蛋白的靶向治疗药物，成为提高治疗效果和降低毒性的重要方向。

在众多潜在的治疗靶点中，PLK1（Polo-like Kinase 1）因其在细胞周期调控中的关键作用而备受关注。PLK1属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，其主要功能包括调控细胞周期进程、细胞分化和细胞存活等。特别是在细胞有丝分裂过程中，PLK1发挥着不可或缺的作用，因此其在大多数人类癌症中均表现出高表达。研究发现，PLK1的过表达与癌症患者的不良预后密切相关，这表明PLK1可能是多种癌症治疗的重要靶点。在多发性骨髓瘤的背景下，PLK1的高表达也与疾病的进展和治疗难度密切相关。因此，针对PLK1的特异性抑制剂的研发，为多发性骨髓瘤的治疗提供了新的思路。

PLK1由两个主要结构域组成：高保守的激酶催化结构域（KD）和具有独特功能的polo盒结构域（PBD）。其中，PBD作为一个磷肽结合模块，对于PLK1识别其底物至关重要。该结构域不仅在细胞周期的不同阶段引导PLK1的亚细胞定位，还在有丝分裂过程中通过与特定磷肽的相互作用，调节PLK1的活性和功能。由于PBD的结构特性，其成为设计选择性PLK1抑制剂的理想靶点。然而，现有的PLK1-PBD抑制剂，如Thymoquinone、Poloxin和MCC1019等，往往存在选择性不足、生物稳定性差等问题，限制了其在临床转化中的应用潜力。

为了克服上述局限性，本研究采用了一种集成的虚拟筛选策略，成功识别出五种针对PLK1-PBD的新型肽类抑制剂（PLs 1–5）。这一策略结合了药效团建模和分子对接等计算方法，用于筛选和优化具有高亲和力和特异性的肽药物。通过药效团建模，研究人员首先对PLK1-PBD与配体的结合模式进行了系统分析，识别出关键的结合位点和相互作用模式。基于这些信息，构建了具有四个主要特征的药效团模型，包括两个氢键受体、一个氢键供体和一个疏水中心。随后，利用该模型对包含15,625种肽的数据库进行了虚拟筛选，从中筛选出54种候选肽，这些肽在结构上与药效团特征高度匹配。为了进一步验证筛选结果的可靠性，研究人员采用分子对接方法，对这些候选肽进行了结合位点分析，并通过分子动力学（MD）模拟评估了其与PLK1-PBD的结合稳定性。

实验结果表明，PL-1在所有候选肽中表现出最强的结合亲和力，其解离常数（Kd）仅为3.11 ± 0.05 nM，显著优于其他候选肽。这一结果表明PL-1能够高效地与PLK1-PBD结合，从而可能发挥更强的抑制作用。此外，研究人员还通过微尺度热泳（MST）实验进一步验证了PL-1的结合能力，并发现其与PLK1-PBD的结合亲和力比之前报道的PLK1-PBD抑制剂肽5高出约21倍。这一显著提升的结合能力，使得PL-1在药物开发过程中具有更强的竞争力。

为了评估PL-1的特异性，研究人员还进行了激酶选择性实验。结果显示，PL-1对PLK家族的其他成员（如PLK2、PLK3、PLK4和PLK5）几乎没有抑制作用，这表明PL-1具有较高的选择性，能够有效避免对非靶点激酶的干扰。这种选择性对于减少药物的副作用和提高治疗安全性至关重要。此外，PL-1在对一组广泛激酶的测试中也表现出较低的抑制率，进一步支持了其作为PLK1特异性抑制剂的潜力。

除了结合亲和力和选择性，PL-1的生物稳定性同样值得关注。研究人员通过体外实验评估了PL-1在人类血清和肝微粒体中的稳定性。结果显示，PL-1在人类血清中表现出比肽5更优异的稳定性，其在120分钟内的残留率约为75%，而肽5在240分钟内几乎完全降解。此外，在肝微粒体中，PL-1的半衰期（T1/2）为36 ± 0.5分钟，而肽5的半衰期仅为15 ± 0.3分钟。这表明PL-1在体内具有更长的作用时间，有助于维持有效的血浆浓度，从而提高其治疗效果。这些生物稳定性数据为PL-1的进一步临床研究提供了重要的支持。

在细胞层面，研究人员还评估了PL-1的细胞摄取能力。通过荧光显微镜观察，发现PL-1在U266多发性骨髓瘤细胞中能够高效地进入细胞内部，表现出显著的细胞摄取能力。这一特性对于肽类药物的靶向作用至关重要，因为只有能够有效进入细胞的药物才能发挥其治疗作用。此外，PL-1的细胞摄取能力也与其高结合亲和力和选择性密切相关，表明其在细胞内的作用效率可能更高。

为了进一步验证PL-1的抗肿瘤潜力，研究人员还进行了MTT实验，评估其对U266细胞的抗增殖活性。实验结果显示，PL-1对U266细胞的抑制率显著高于肽5和已知的PLK1-KD抑制剂BI 2536。其中，PL-1的半数抑制浓度（IC50）仅为0.09 ± 0.01 μM，远低于肽5（IC50 = 2.25 ± 0.11 μM）和BI 2536（IC50 = 0.28 ± 0.03 μM）。这一结果表明，PL-1在抑制多发性骨髓瘤细胞增殖方面具有显著的优势，显示出其作为抗肿瘤药物的潜力。

此外，分子动力学模拟进一步验证了PL-1与PLK1-PBD结合的稳定性。模拟结果显示，PL-1与PLK1-PBD形成的复合物在整个模拟过程中保持了结构的稳定性，其根均方偏差（RMSD）和根均方波动（RMSF）值均较低，表明该复合物在生理条件下具有良好的结构保持能力。同时，PL-1与PLK1-PBD结合后，其二级结构没有发生显著变化，进一步支持了其作为稳定结合剂的特性。

综上所述，PL-1在结合亲和力、选择性和生物稳定性方面均表现出显著的优势，使其成为多发性骨髓瘤治疗中的一个极具前景的候选药物。该肽不仅能够高效地抑制PLK1的活性，还能通过其独特的结构特性，减少对其他激酶的干扰，从而降低潜在的副作用。此外，PL-1的高效细胞摄取能力和良好的生物稳定性，使其在体内具有更长的药效持续时间，能够维持有效的治疗浓度。这些特性使得PL-1在临床转化过程中具有较高的可行性。

本研究的成果不仅为多发性骨髓瘤的治疗提供了新的药物候选，也为靶向PLK1的抗肿瘤药物设计提供了重要的参考。通过集成虚拟筛选策略，研究人员成功筛选出具有高亲和力和特异性的肽类药物，这为未来开发更安全、更有效的靶向治疗药物奠定了基础。此外，PL-1的结构特性，如N端乙酰化和C端氨基化，也为提高其生物稳定性提供了可能的修饰方向。未来的研究可以进一步探讨PL-1在体内作用机制，以及其与其他靶点的相互作用，以评估其在多种癌症治疗中的潜在应用价值。同时，考虑到PL-1的高效性和安全性，其在临床试验中的表现值得期待。这一研究为癌症靶向治疗的发展提供了新的思路和方向，具有重要的科学和临床意义。