基因簇重构与异源表达创制新型吡啶吡咯酮类杀虫先导化合物

本研究通过合成生物学策略，成功在构巢曲霉中重构吡啶吡咯酮A（PP-A）生物合成基因簇（BGC），获得5个新型1-酮基吡啶吡咯酮衍生物。其中化合物1、2、5为首次发现的1-酮基结构类型，杀虫活性显著优于1-羟基类似物，为新一代杀虫剂研发提供了创新先导化合物。

　　

引言

真菌聚酮-萜类杂合代谢物吡啶吡咯酮A（pyripyropene A, PP-A）具有显著的生物活性，包括强效抑制酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶（ACAT）和对蚜虫的高杀虫活性。以其为基础开发的半合成衍生物afidopyropen（商品名Inscalis?）已在全球多个国家商业化应用。吡啶吡咯酮类化合物（PPs）具有特征性的杂萜骨架，由C15-三环萜烯单元与聚酮衍生的吡啶取代吡喃酮环融合而成。天然存在的PPs通常在C-1、C-7、C-11和C-13位含有羟基，其中C-1、C-7和C-11位的羟基常被乙酰化。通过基因簇鉴定，PPs的生物合成途径已在烟曲霉和粪生青霉等真菌中得到阐明。关键酶步骤涉及细胞色素P450单加氧酶（Pyr3和Pyr9）催化的特异性羟基化反应，以及乙酰转移酶（Pyr7和Pyr8）对羟基的乙酰化修饰。

材料与方法

本研究使用含PP-A生物合成基因簇（BGC）的烟曲霉Af 293和作为异源表达宿主的三重营养缺陷型构巢曲霉LO8030。通过PCR从烟曲霉基因组DNA中扩增BGC基因，利用酿酒酵母BJ5464进行体内重组构建质粒。首先构建了用于异源表达CoA连接酶基因pyr1和迭代型I型聚酮合酶（PKS）基因pyr2的“大肠杆菌-酵母-曲霉”穿梭质粒pSJ1，转化构巢曲霉后获得转化子SSJ1。随后构建含环化酶基因pyr4、黄素依赖单加氧酶（FMO）基因pyr5和跨膜异戊二烯转移酶（PTase）基因pyr6的质粒pSJ9，通过同源重组整合到SSJ1的yA基因座，获得转化子SSJ9。进一步构建含细胞色素P450单加氧酶基因pyr3和pyr9的质粒pSJ10、含双拷贝pyr3的pSJ12和含双拷贝pyr9的pSJ13，并分别转化SSJ9，靶向整合于wA基因座，获得三种不同的吡啶吡咯酮异源表达转化子SSJ10、SSJ12和SSJ13。

发酵与代谢物分析在含20 g/L淀粉（诱导基因表达）和1 g/L烟酸（PPs前体）的液体GMM培养基中进行，30℃、180 r/min振荡培养7天。通过超声辅助提取和乙酸乙酯萃取获得代谢产物粗提物，经HPLC和LC-TOF-MS分析。大规模发酵在10 L培养基中进行，粗提物经硅胶柱色谱和制备型HPLC分离纯化，所得化合物通过600 MHz NMR（包括¹H NMR、¹³C NMR、HSQC、HMBC、¹H-¹H COSY和NOESY）进行结构解析。杀虫活性测定采用活植株喷雾法，测试化合物对豆蚜的致死效果。

结果与讨论

通过在构巢曲霉LO8030中共表达pyr1、pyr2、pyr6、pyr5和pyr4五个基因，成功产生去乙酰化PPs。转化子SSJ9（表达pyr12654）产生去乙酰吡啶吡咯酮E（6）和一个意外产物1。引入P450基因后，SSJ12（表达pyr3）仅产生1和6，而SSJ10（表达pyr3和pyr9）和SSJ13（表达pyr9）产生六种PP代谢物（1–6）。大规模发酵SSJ13后，通过色谱分离获得纯化合物：1（20 mg）、2（12.8 mg）、3（21.4 mg）、4（17.7 mg）、5（20.5 mg）和6（120 mg）。

化合物1为白色粉末，分子式C₂₅H₂₉NO₄，UV λ_max 230和322 nm显示吡啶-吡喃酮发色团存在。MS显示[M+H]⁺ m/z 408.2168，[M+Na]⁺ m/z 430.1985。NMR分析显示C-1位酮羰基信号（δ_C 216.0）取代了6中C-1的氧合碳信号（δ_C 78.4），HMBC相关证实CH₃-11（δ_H 1.14）和CH₃-15（δ_H 1.08）与C-1相关，确认为去乙酰吡啶吡咯酮E的C-1酮衍生物，命名为1-酮基-吡啶吡咯酮E。

化合物2分子式C₂₅H₂₉NO₅，比1分子量增加16 Da。NMR显示H-13（δ_H 5.00, d, J=4.2 Hz）和C-13（δ_C 60.4）信号，通过¹H-¹H COSY（H-13与H-5相关）和HMBC（H-13与C-2’、C-3’、C-4’、C-5、C-6相关）确定为1的13-羟基衍生物，命名为13-羟基-1-酮基-吡啶吡咯酮E，13-OH构型为β。

化合物3分子式C₂₅H₃₁NO₅，比2分子量增加2 Da，比6增加16 Da。NMR分析显示为6的13-羟基化产物，HMBC相关（H-13与C-2’、C-3’、C-4’）证实结构，确定为去乙酰吡啶吡咯酮G。

化合物4和5分子量分别比3和2增加16 Da。NMR显示CH-OH信号（4: δ_H 3.58, δ_C 76.5; 5: δ_H 3.63, δ_C 75.6），HMBC相关（CH-7与C-6、C-14）确定C-7羟基化，且CH₃-11未羟基化，分别命名为11-脱氧-去乙酰吡啶吡咯酮A和1-酮基-11-脱氧-去乙酰吡啶吡咯酮A。

本研究首次报道1-酮基PPs（1、2、5），推测由构巢曲霉宿主中的短链脱氢酶/还原酶（SDR）催化底物6、3、4的C-1羟基氧化生成。代谢谱分析显示P450 Pyr3具有严格底物选择性，特异性催化1-O-乙酰氧基PPs的修饰；而Pyr9具有催化多样性，可修饰1-羟基、1-酮基和1-乙酰氧基等多种官能团。

杀虫活性测试显示，化合物2和5的抗蚜活性与PP-A（LC₉₀ 0.56 ppm）相当。活性比较为5 > 2 > 1，证实C-7和C-13羟基化对活性至关重要。尽管化合物1仅具C-1酮基化而无7-OH或13-OH修饰，其杀虫活性仍与3和4相当，表明1-酮基引入显著增强PPs杀虫活性。

结论

通过在真菌底盘宿主构巢曲霉LO8030中异源表达设计的吡啶吡咯酮生物合成基因簇，成功获得五种新型吡啶吡咯酮衍生物。本研究首次分离得到1-酮基吡啶吡咯酮类化合物，其杀虫活性显著强于1-羟基类似物，证明1-酮基功能化在开发新一代吡啶吡咯酮类杀虫剂中的巨大潜力。

作者贡献

S. Jia和Y. Wu进行异源表达实验；S. Jia和Y. Chen构建质粒；S. Jia、Q. Yin和J. Xu进行化合物分离与结构鉴定；S. Jia、Y. Tang和Y. Cui参与数据分析与讨论；S. Jia、J. Xu、P. Wang和D. Ji撰写稿件；J. Xu、P. Wang和Y. Tang指导研究。