基于CRISPR-Cas9筛选的领鞭毛虫基因敲除新方法揭示Hippo信号通路调控多细胞发育的保守机制

为解决领鞭毛虫Salpingoeca rosetta基因敲除(CRISPR-Cas9)效率低、耗时长的问题，研究人员开发了基于抗生素筛选的快速敲除方法。通过该方法成功敲除Hippo通路基因warts，发现其通过调控胞外基质(ECM)分泌控制多细胞团簇大小，揭示了动物多细胞化进化的重要线索。该研究为后生动物起源研究提供了强大工具和机制见解。

　　

在探索动物起源的奥秘时，科学家们将目光投向了动物最亲近的单细胞亲戚——领鞭毛虫。其中Salpingoeca rosetta因其能够形成类似动物胚胎发育早期阶段的多细胞团簇（rosette）而成为研究多细胞化进化的重要模型。尽管十年前S. rosetta就已成为遗传操作可行的模型，但现有的基因敲除方法存在效率低、耗时长的问题，成功率仅0.3%-16.5%，通常需要分离和基因分型数百个克隆才可能获得敲除株系，这严重限制了功能遗传学研究进展。

发表在《Cell Reports》的这项研究开发了一种快速、高效的基因敲除方法，通过CRISPR-Cas9介导的同源重组（HDR）将带有抗生素抗性基因的终止/抗性盒插入或替换目标基因，实现了对S. rosetta多个基因的高效敲除。研究人员应用该方法成功敲除了三个已知的多细胞发育调控基因（rosetteless、couscous和jumble）和两个Hippo信号通路同源基因（warts和yorkie），发现warts敲除导致团簇异常增大，揭示了Hippo通路在调控领鞭毛虫多细胞大小中的重要作用。

研究采用的主要技术方法包括：基于CRISPR-Cas9核糖核蛋白（RNP）的基因编辑系统、双链修复模板的PCR制备、Lonza 4D核转染技术、嘌呤霉素抗性筛选系统，以及RNA测序（RNA-seq）和全基因组测序等组学分析技术。所有实验均使用领鞭毛虫Salpingoeca rosetta与细菌Echinicola pacifica的共培养体系（SrEpac）。

Targeted insertion of the termination/resistance cassette allows fast, robust, and specific KO of rosetteless

研究人员首先以rosetteless基因为测试案例，使用带有50bp、80bp或155bp不同长度同源臂的修复模板，成功实现了终止/抗性盒（1944bp）在目标位点的精确插入。所有187个嘌呤霉素抗性克隆均表现出rtls突变表型，基因分型证实了终止/抗性盒的成功整合，编辑效率达到100%。全基因组测序显示插入特异性高，且细胞增殖速度与野生型相近。

Both RNP and repair templates are necessary for KO

对照实验表明，只有同时转染RNP和修复模板才能实现高效基因敲除。单独转修复模板会导致环化形成附加体 episomal element，说明Cas9诱导的双链断裂是高效同源重组所必需的。

KO of couscous and jumble confirms the role of glycosyltransferases in rosette development

成功敲除jumble和couscous基因（效率分别为40%和100%），突变体表现出与已知突变体相同的表型——形成不规则细胞团块而非正常团簇，且涡旋振荡后容易解离，证实了这些糖基转移酶在多细胞发育中的关键作用。

Editing of Hippo pathway genes reveals a role for Warts kinase in setting rosette size

针对Hippo通路核心组分（Hippo、Warts和Yorkie）的敲除实验发现，wartspac/1突变体的团簇显著大于野生型（21.1±4.4 vs 10.2±1.7细胞/团簇），而yorkiepac/1和hippopac/1的团簇大小与野生型无显著差异。值得注意的是，wartspac/1细胞增殖速度反而比野生型慢10%。

RNA sequencing reveals successful inactivation of warts in the wartspac/1 allele but probable persistent gene function due to alternative start codons in hippopac/1 and yorkiepac/1

RNA测序分析显示，wartspac/1中warts基因成功被敲除，而hippopac/1和yorkiepac/1中由于存在替代起始密码子，可能仍产生截短但功能性的蛋白。差异表达分析发现wartspac/1中46个基因显著上调，包括7个ECM组分、4个糖基化酶和多个激酶，表明Warts主要通过抑制靶基因转录发挥作用。

Editing with two simultaneous gRNAs allows deletion of warts and yorkie

为确保证实基因功能完全缺失，研究人员开发了双gRNA删除策略，成功获得warts和yorkie的缺失突变体（wartspac△1和yorkiepac△1），但未能获得hippo缺失突变体，提示hippo基因可能是必需基因。

RNA-seq reveals upregulation of ECM components in wartspac/1 cells

对缺失突变体的转录组分析发现，warts缺失导致188个基因上调，其中22个与插入突变体中的上调基因重叠，包括纤维状胶原蛋白、C型凝集素和糖基化酶等。这些基因在yorkie缺失突变体中显著下调，证实了Hippo通路调控逻辑在领鞭毛虫中的保守性。

研究结论表明，该研究建立了两种高效的基因敲除方法（插入和删除），其中删除法更可靠地确保基因功能完全缺失。发现Hippo通路通过调控ECM分泌来控制多细胞团簇大小，这一机制不同于动物中常见的调控增殖方式，但与某些动物组织中的YAP/TAZ调控ECM的功能相似。该研究不仅为领鞭毛虫功能遗传学研究提供了强大工具，还为理解多细胞化进化提供了重要机制见解，揭示了Hippo通路功能在动物进化过程中的复杂演化历程——从调控细胞形态（如filastereans）到调控ECM分泌（如choanoflagellates）再到调控增殖（如动物）的功能创新。

研究的局限性包括目前只能进行单基因敲除，未来需要开发更多选择性标记来实现多重基因敲除；此外，修复模板偶尔会环化形成附加体，需要进一步优化方法防止这种情况发生。尽管如此，这项工作标志着领鞭毛虫功能遗传学研究进入了一个新阶段，为大规模基因组筛选和研究动物起源的遗传基础铺平了道路。