单剂量纳米颗粒疫苗在临床前模型中提供针对猴痘的全面保护：一种基于A35-M1双抗原的“二合一”纳米疫苗策略

本刊推荐：为应对猴痘病毒(MPXV) clade Ib和IIb谱株带来的持续威胁，研究者开发了一种基于自组装铁蛋白纳米颗粒的“二合一”疫苗DAM-NP，该疫苗通过共价展示A35和M1双抗原，在临床前模型中证实单剂免疫即可诱导强大的交叉中和抗体（针对VACV-WR、VTT和MPXV）和细胞免疫应答，且预存免疫力不影响其效果，为新一代猴痘疫苗的开发提供了重要理论与实践依据。

　　

近年来，猴痘病毒(MPXV)的持续爆发与演变已成为全球公共卫生的重大挑战。自2022年以来，MPXV clade IIb引起的疫情已蔓延至100多个国家和地区，造成超过12万例确诊和272例死亡。更令人担忧的是，高毒力的clade Ib变异株的出现，进一步加剧了其传播力与致病性。世界卫生组织(WHO)已两次宣布猴痘疫情为“国际关注的公共卫生紧急事件”。目前，针对猴痘的预防仍依赖天花疫苗，如非复制型痘苗病毒安卡拉株(MVA-BN)和复制型疫苗ACAM2000等，但这些疫苗存在抗体衰减快、对免疫缺陷人群安全性差、且受预存免疫力干扰等局限。因此，开发安全、高效且能克服预存免疫的新型猴痘疫苗迫在眉睫。

在这一背景下，Run-Yu Yuan、Meng-Jun Li、Xiao-Bing Lin等研究者于《Cell Reports》发表了一项创新性研究，他们设计了一种基于蛋白质纳米颗粒的“二合一”疫苗——DAM-NP，该疫苗通过将MPXV的A35（胞外病毒颗粒糖蛋白）和M1（胞内成熟病毒颗粒膜蛋白）抗原以二聚体形式融合，并共价展示在自组装的24聚体铁蛋白纳米颗粒表面，从而实现了高效免疫原呈递与协同免疫激活。研究表明，单剂DAM-NP免疫即可在小鼠和兔子中诱导出高滴度的交叉中和抗体，完全保护小鼠免受致死性MPXV和痘苗病毒西方保留株(VACV-WR)攻击，且预存免疫力不仅不干扰其效果，反而表现出协同增强作用。

研究主要采用了以下关键技术方法：首先，利用GvTagOpti/SdCatcher(GvO/Sd)共价偶联系统构建DAM-NP纳米疫苗；其次，通过动态光散射(DLS)、尺寸排阻色谱(SEC)和透射电镜负染色(TEM)表征疫苗理化性质；第三，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)、生物膜干涉技术(BLI)和竞争结合实验评估抗原抗体结合活性与亲和力；第四，通过空斑减少中和试验(PRNT)和微量中和试验评价血清中和抗体效价；第五，利用流式细胞术分析疫苗诱导的T滤泡辅助细胞(T_FH)、生发中心B细胞(GC B)及抗原特异性T细胞反应（包括IFN-γ⁺、TNF-α⁺ CD4⁺/CD8⁺ T细胞）；最后，在ABSL-3实验室开展MPXV和VACV-WR攻毒实验，监测体重变化、生存率及组织病毒载量，并通过病理切片(H&E染色)评估肺组织损伤。研究中使用的MPXV临床分离株来自深圳市第三人民医院患者样本，疫苗免疫原性及保护力评价均在BALB/c小鼠和新西兰兔模型中进行。

Construction and characterization of the MPXV DAM-bearing NP vaccine

研究者首先成功构建了DAM-NP疫苗，该疫苗由融合抗原GvO-DAM（含GvTagOpti标签的A35-M1二聚体）与Sd-HPF（含SdCatcher标签的铁蛋白纳米颗粒）通过体外共孵育自组装形成。AlphaFold 3结构预测显示，DAM-NP呈高度有序的纳米颗粒形态，抗原以 spikes 形式突出于颗粒表面。SDS-PAGE和SEC证实疫苗纯度高达95%以上，动态光散射显示其水合粒径为31.2 nm，多分散指数(PDI)低于0.2，表明颗粒均一性好。负染TEM直观展示了DAM-NP的典型纳米颗粒结构及表面spikes。抗原性分析通过ELISA和BLI证明，DAM-NP与M1特异性单抗（7D11、M1H11）及A35特异性单抗（A27D7）的结合亲和力较可溶性DAM提高100倍以上，且竞争实验表明M1与A35表位无相互干扰，提示纳米颗粒呈现显著提升了抗原的亲和力与空间可及性。

DAM-NP vaccine elicited robust humoral immune responses in BALB/c mice

在小鼠免疫实验中，单剂DAM-NP（0.2 μg或1 μg）免疫14天后即可诱导出显著高于可溶性DAM组的A35、M1及DAM特异性IgG抗体滴度，且抗体水平与MPXV感染者恢复期血清(HCS)相当或更高。亚型分析显示DAM-NP诱导了平衡的T_H1/T_H2反应（IgG2a/IgG1比值接近1）。更重要的是，中和抗体检测发现，单剂DAM-NP免疫后血清对VACV-WR的中和效价（PRNT₅₀ 4.2×10²）显著高于DAM组（PRNT₅₀ 6×10¹），加强免疫后其中和效价进一步提升（PRNT₅₀ 1.26–1.89×10³），达到HCS水平（PRNT₅₀ 2.14×10²）。这些结果表明，纳米颗粒载体通过促进抗原呈递和B细胞受体(BCR)交联，显著增强了疫苗的免疫原性。

DAM-NP vaccine conferred cross-protection against both VTT and lethal VACV-WR challenges in BALB/c mice

攻毒实验显示，经两次免疫的小鼠在致死剂量VACV-WR（35 LD₅₀）攻击后，DAM-NP组小鼠体重仅轻微下降并迅速恢复，存活率达100%，而mock组全部死亡。肺组织病毒载量检测发现DAM-NP组病毒滴度接近检测下限（1×10² PFU/g），病理切片显示其肺组织仅见轻微炎症浸润，肺泡隔增厚不明显，表明疫苗能有效清除病毒并减轻组织损伤。此外，低毒力痘苗病毒天坛株(VTT)攻击实验也证实DAM-NP组病毒复制水平极低，进一步说明其交叉保护效果。

DAM-NP vaccine elicited high levels of neutralizing antibodies in New Zealand rabbits

在新西兰兔模型中，DAM-NP同样展现出卓越的免疫原性。单剂免疫后，血清对MPXV clade Ib中和抗体滴度较DAM组提高3.8倍，加强免疫后其对VACV-WR和VTT的中和效价进一步提升7.2倍和2.3倍。竞争性BLI实验发现，DAM-NP免疫血清与M1表位抗体（尤其是7D11类抗体）竞争结合能力更强，提示纳米颗粒促使免疫应答集中于关键中和表位，而A35表位则未显优势，这可能与抗原在颗粒表面的空间取向有关。

Pre-existing antibodies do not interfere with the immunogenicity and protective efficacy of DAM-NP vaccine

为模拟已接种天花疫苗人群的预存免疫状态，研究者先用VTT感染小鼠，再给予单剂DAM-NP免疫。结果发现，预存免疫力非但未削弱疫苗效果，反而使中和抗体滴度进一步提升（对MPXV clade Ib和VACV-WR分别提高129倍和14.3倍）。攻毒实验显示，VTT预感染+DAM-NP组小鼠在致死性VACV-WR攻击后体重损失最轻，肺和鼻甲病毒载量最低，尽管病理切片显示其肺组织仍有较明显炎症（可能与连续病毒攻击引发的强免疫反应有关），但所有小鼠均存活。这表明DAM-NP疫苗能克服预存免疫的干扰，甚至产生协同增效。

DAM-NP vaccine stimulated robust T cell responses in mice

细胞免疫分析显示，单剂DAM-NP免疫可显著提升淋巴结中GC B细胞和T_FH细胞比例，说明其促进生发中心反应和抗体亲和力成熟。脾细胞刺激实验发现，DAM-NP组经VACV-WR或MPXV抗原（A35、M1）刺激后，IFN-γ⁺ CD4⁺/CD8⁺ 和TNF-α⁺ CD8⁺ T细胞频率显著高于对照组，表明其诱导了强烈的T_H1和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应，而IL-4⁺ T细胞应答较弱，进一步印证了其偏向T_H1的免疫应答特征。

A single dose of the DAM-NP vaccine protected mice against lethal MPXV challenge

最终，研究在ABSL-3实验室用真实MPXV clade IIb病毒验证了疫苗的保护效力。单剂DAM-NP免疫后14天，血清对MPXV的中和效价即达显著水平。攻毒后，mock组小鼠全部死亡，而DAM-NP组无一死亡，体重损失最小且恢复最快，肺病毒载量显著低于DAM组。这表明单剂DAM-NP足以提供完全保护，凸显其作为应急疫苗的巨大潜力。

综上所述，本研究开发的DAM-NP纳米疫苗通过理性设计实现了“二合一”抗原的高效呈递，克服了现有多价mRNA疫苗可能存在的抗原干扰、表位掩蔽及冷链需求高等问题。其单剂高效、交叉保护、克服预存免疫及强细胞应答等特点，使其成为新一代猴痘疫苗的杰出候选。未来工作需在非人灵长类模型验证其长效保护力，并与已上市疫苗（如MVA-BN）进行头对头比较。该研究不仅为猴痘防治提供了新策略，也为针对其他病原体的纳米疫苗设计提供了重要参考。