桃红四物汤通过PI3K/AKT/GSK-3β信号通路调控EMT改善肾纤维化的机制研究

本研究结合网络药理学与细胞实验验证，首次系统阐明桃红四物汤（THSWD）通过主要活性成分β-谷甾醇抑制PI3K/AKT/GSK-3β信号通路磷酸化，调控上皮-间质转化（EMT）关键标志物（E-cadherin/Twist/N-cadherin/Vimentin/α-SMA/Fibronectin），从而显著改善TGF-β诱导的肾小管上皮细胞纤维化表型，为慢性肾脏病（CKD）的治疗提供了多靶点作用机制和新颖治疗策略。

　　

引言

慢性肾脏病（CKD）是指由各种原因导致的肾脏结构或功能持续≥3个月的损害。其全球患病率高达9.1%，约影响6.975亿人，每年导致120万人死亡，构成重大全球健康问题。肾纤维化是各种慢性肾脏疾病的共同病理过程，主要与炎症细胞浸润、促纤维化通路异常激活、细胞外基质（ECM）积累和上皮-间质转化（EMT）相关。肾小管上皮细胞损伤被认为是肾纤维化的触发因素，当肾小管上皮细胞受损时，它们会发生EMT，转化为间质细胞，成为肾组织中肌成纤维细胞的来源。纤维细胞的异常增加导致ECM合成增强，造成ECM合成与降解失衡，大量ECM在肾脏中沉积诱导肾纤维化。因此，抑制肾小管上皮细胞EMT是延缓或预防肾纤维化、管理慢性肾脏病的关键策略。

PI3K/AKT信号通路是调控EMT的经典通路，其下游靶点为糖原合成酶激酶3β（GSK3β）。GSK3β广泛存在于各种细胞中，主要在肾脏的肾小球和近端小管中表达。PI3K激活后，AKT被磷酸化，进而触发GSK3β在Ser-9位点的磷酸化和失活。失活的GSK3β抑制E-cadherin表达，同时促进N-cadherin和Vimentin的表达，从而激活肾小管上皮细胞的EMT，增加ECM合成，促进肾纤维化。研究表明，抑制PI3K/AKT/GSK3β信号通路的激活可以缓解EMT，改善肾纤维化，从而减缓慢性肾脏病的进展。

桃红四物汤（THSWD）源自清代医学著作《医宗金鉴》，由桃仁、红花、地黄、白芍、当归和川芎组成。其功能包括促进气循环、破瘀、活血和养血。根据中医理论，肾纤维化与气和血瘀有关。临床研究表明，THSWD能有效减缓慢性肾脏病患者肾功能下降。此外，研究显示THSWD能改善大鼠肝纤维化和肺纤维化，但其治疗慢性肾纤维化的机制尚不清楚。

由于中药复方成分复杂，其作用机制往往难以全面阐明。网络药理学可以将中药成分与疾病靶点整合进行综合分析。因此，本研究采用网络药理学和实验验证相结合的方法，识别THSWD的主要活性成分和靶点。通过网络拓扑分析、基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析，探索其信号通路和作用机制。选择TCMK1细胞，因其能够重现TGF-β诱导的EMT，这是肾纤维化中肾小管损伤的标志。这些发现通过细胞实验进一步验证，为THSWD治疗CKD的机制提供了新的见解，并为其临床应用提供了实验证据。

方法

活性成分与靶点筛选

从中药系统药理学数据库（TCMSP）中筛选THSWD的主要活性成分，筛选标准为口服生物利用度（OB）> 30%和类药性（DL）> 0.18。随后，使用UniProt数据库将获得的蛋白靶点校正为其官方名称，并排除不符合筛选标准的药物靶点。

肾纤维化靶点获取

从基因表达综合（GEO）数据库下载CKD的基因表达矩阵GSE66494，其中包括53名CKD患者和8名正常肾组织样本的数据。使用R中的“WGCNA”包构建基因共表达网络。去除异常值后，确定最佳软阈值（β）。基于尺度自由网络分布对基因表达进行层次聚类。不同的簇代表不同的模块，将具有相似表达模式的基因分配到一个共表达模块中。识别与CKD高度相关的模块，并提取这些模块中的基因作为肾纤维化的靶点。

网络构建与分析

获得THSWD靶点与肾纤维化靶点的交集，以确定治疗靶点。这些治疗靶点用于映射THSWD的相关成分，从而构建“药物-成分-靶点”相互作用数据集。使用Cytoscape 3.7.1软件分析和可视化THSWD成分与肾纤维化靶点之间的网络关系。在网络图中，节点代表THSWD的成分和靶点，边代表成分与靶点之间的相互作用。软件分析网络拓扑参数，包括介数中心性、度中心性和接近中心性，以识别主要活性成分及其对应靶点。

蛋白互作（PPI）网络构建与关键靶点筛选

为了识别靶点之间的相互作用，构建了蛋白互作（PPI）网络。将靶点蛋白输入STRING在线数据库，物种设置为智人（Homo sapiens），以获得蛋白相互作用关系。然后使用Cytoscape 3.7.1软件进行可视化，并使用“cytoHubba”插件进行网络拓扑分析。“cytoHubba”插件包括12种计算方法，其中MCC（最大团中心性）方法在预测核心蛋白方面表现最佳。因此，我们根据MCC算法将靶点从高到低排序，值越高表示靶点越重要。

富集分析

将靶点基因输入DAVID数据库进行GO功能富集和KEGG通路富集分析。结果根据P值和FDR进行排序。然后使用在线绘图网站Bioinformatics对排名靠前的GO功能和KEGG信号通路进行可视化。

分子对接

根据介数中心性、度中心性和接近中心性的结果，选择前4个主要活性成分。它们的结构文件从TCMSP数据库获得。选择PPI网络中的前4个关键靶点，并从蛋白质数据库（PDB）中检索它们的3D结构。使用AutoDock 4.2.6软件进行分子对接，并根据结合能的绝对值评估对接结果。使用PyMOL软件可视化结果。

药物与试剂

β-谷甾醇是一种甾体化合物，大量存在于大豆和玉米中，化学式为C₂₉H₅₀O，分子量为414.707。β-谷甾醇购自成都普瑞法（批号：PRF21031502）。将其完全溶解在二甲基亚砜（DMSO）中，并在-20°C下储存。每次使用前，在室温下溶解，并用含10%血清的无菌培养基稀释，以确保DMSO浓度低于0.1%。其他试剂包括DMEM/高葡萄糖培养基（BasalMedia，中国）、胎牛血清（FBS）（Gibco，美国）、重组小鼠TGF-β（联科生物，中国）、DMSO（Sigma，德国）、胰蛋白酶（Solarbio，中国）、青霉素-链霉素溶液（Solarbio，中国）、PBS（Solarbio，中国）、蛋白标记物（Thermo Fisher，美国）、PMSF蛋白酶抑制剂（Thermo Fisher，美国）、RIPA蛋白裂解缓冲液（Solarbio，中国）、MTT检测试剂盒（生工，中国）、HRP标记的山羊抗兔二抗（中杉金桥，中国）、GAPDH兔IgG抗体（艾博韦泰，中国）、Fibronectin兔IgG抗体（艾博泰克，中国）、α-SMA兔IgG抗体（博奥森，中国）、P-AKT/AKT兔IgG抗体（艾博泰克，中国）、P-PI3K/PI3K兔IgG抗体（Cell Signaling Technology，中国）、P-GSK3β/GSK3β兔IgG抗体（Affinity，美国）、N-cadherin兔IgG抗体（Proteintech，中国）、Vimentin兔IgG抗体（Proteintech，中国）、Twist兔IgG抗体（Abcam，英国）、E-Cadherin兔IgG抗体（Proteintech，中国）和SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（5× loading buffer）（碧云天，中国）。

细胞培养与处理

TCMK1肾小管上皮细胞（ATCC，cat# CCL-139，美国）在补充有10% FBS和1%青霉素-链霉素的DMEM中，在标准条件下（37°C，5% CO₂，100%湿度）培养。细胞在80%–90%汇合时传代。传代前，生物安全柜用紫外线灭菌30分钟，并将DMEM、胰蛋白酶和PBS预热至室温。吸弃培养基，用PBS洗涤细胞，并用胰蛋白酶消化1–2分钟，直至细胞变圆并部分脱落。通过加入10%完全培养基终止消化，并将细胞悬液以1000 rpm离心3-5分钟。将沉淀重悬于完全培养基中，并接种到培养皿中。细胞在标准条件下培养，每天监测汇合度并根据需要传代。为了构建体外纤维化模型，将TCMK1细胞以80%–90%汇合度接种在6孔板中。弃去旧培养基后，用PBS洗涤细胞，并用含0.5% FBS的DMEM孵育12小时进行饥饿处理。随后，每孔加入5 ng/mL TGF-β，再孵育12小时以诱导纤维化。

对于冻存，将重悬的细胞与DMSO（终浓度10%）混合，分装到冻存管中，并进行程序性冷冻至-80°C，然后储存于液氮中。复苏的细胞在37°C水浴中快速解冻，以1200 ×g离心3分钟，重悬于完全培养基中，并在6 cm培养皿中培养。

MTT assay

对于MTT assay，消化TCMK1细胞，计数，并以每孔约4000个细胞的密度接种到96孔板中。当细胞达到约70%汇合时，用不同浓度的β-谷甾醇（0, 5, 10, 20, 40, 80, 100 μmol·L^?1）处理。每个浓度设置五个复孔。孵育24小时后，每孔加入20 μL MTT溶液，再孵育4小时。然后弃去上清液，每孔加入150 μL DMSO以溶解甲臜晶体。将板振荡10分钟以确保完全溶解，并使用酶标仪在570 nm处测量吸光度。

Western blot检测蛋白表达

使用补充有1% PMSF的RIPA裂解缓冲液提取细胞蛋白，然后在4°C下以12,000 rpm离心15分钟以收集上清液。取等量蛋白（每孔30 μg）进行变性，通过SDS-PAGE分离，并转移到PVDF膜上。用5% BSA封闭膜，在4°C下与一抗（如GAPDH、α-SMA、Fibronectin、Vimentin、N-cadherin、PI3K、P-PI3K、AKT、P-AKT、GSK3β、P-GSK3β、Twist）孵育过夜，然后在室温下与二抗孵育1小时。使用化学发光法进行检测，并对条带强度进行量化分析。所有实验均进行三次独立的生物学重复（n = 3）。

统计分析

使用R 4.2.2和统计软件GraphPad Prism 9分析数据。结果以“均值±标准差”表示。多组比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）。P值< 0.05被认为具有统计学意义。使用ImageJ软件处理蛋白条带图像并分析灰度值。

结果

活性成分与靶点

共鉴定出THSWD的61个活性成分和222个靶点。通过UniProt数据库获得了靶点的标准基因名称。活性成分列于表1。

肾纤维化靶点

对GSE66494表达矩阵进行标准化，然后使用R中的“WGCNA”包进行分析。样本的层次聚类识别出两个异常值（GSM1623313, GSM1623315）。去除这些异常值后，根据尺度自由拓扑标准选择软阈值18（R2 = 0.9），以确保尺度自由网络分析，将表达矩阵转换为加权网络。使用皮尔逊相关系数对样本进行聚类，得到样本聚类树。将邻接矩阵转换为TOM矩阵，以表示基于节点间加权相关性的节点间相似性。

使用平均层次聚类和动态树切割，获得了22个模块。黄色模块显示与CKD的相关性为0.39（p = 0.002），深绿色模块显示与CKD的相关性为-0.33（p = 0.01），表明它们与CKD高度相关。灰色模块代表未纳入其他模块的基因，被排除在分析之外。从黄色和深绿色模块中总共提取了5778个基因作为肾纤维化靶点，并生成了相关性结果的散点图。

THSWD成分-肾纤维化靶点网络构建

THSWD靶点与从WGCNA获得的肾纤维化靶点的交集产生了59个共同靶点，如维恩图所示，这些被确定为THSWD治疗肾纤维化的靶点。映射这些治疗靶点确定了THSWD中治疗肾纤维化的37个活性成分。将“药物-成分-靶点”数据输入Cytoscape 3.7.1软件，构建了“THSWD成分-药物成分-肾纤维化靶点”网络。

进行了拓扑分析，根据介数中心性、接近中心性和度中心性等关键参数对成分进行排序。表2列出了前8个活性成分，包括β-谷甾醇、豆甾醇、槲皮素和山奈酚，这些被认为是THSWD发挥抗纤维化作用的主要成分。

PPI网络构建

将药物成分和疾病的59个共同靶点输入STRING 11.5平台构建PPI网络。使用Cytoscape 3.7.1软件中的“cytoHubba”插件对网络进行拓扑分析。使用MCC算法，识别出前10个靶点并进行可视化。这些靶点包括ESR1、AKT1、IFNG、IL2、MMP2、IL1A和IL4，这些被认为是THSWD治疗肾纤维化的关键靶点。详细信息见表3。

富集分析结果

使用DAVID平台对药物成分和疾病的59个共同靶点进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，显著性阈值设为p < 0.05。结果揭示了117个生物过程条目、39个分子功能条目和30个细胞组分条目。使用生物信息学在线绘图网站对每个类别中按P值排名前20的结果进行可视化。如图所示，在生物过程中，THSWD显著影响细胞增殖的正向调控、无配体时的外源性凋亡信号通路以及对异生物刺激的反应。在分子功能方面，它主要与抑制性细胞外配体门控离子通道活性、神经递质受体活性和氯离子通道活性相关。在细胞组分方面，它与突触后膜、突触前膜的整体组成部分和树突膜密切相关。KEGG通路富集分析确定了62条通路，表明THSWD主要通过IL-17、PI3K/AKT和P53信号通路发挥抗肾纤维化作用。使用生物信息学在线绘图网站对按P值排名前20的通路进行可视化。

分子对接结果

对前4个关键靶点（ESR1、AKT1、IFNG、IL2）和前4个主要活性成分（β-谷甾醇、豆甾醇、槲皮素、山奈酚）进行了分子对接。结果表明，大多数关键靶点和主要活性成分的结合能小于-4 kcal·mol^?1，表明活性成分与靶蛋白具有良好的结合亲和力。这进一步支持了THSWD可能通过多靶点协同作用改善肾纤维化。其中，β-谷甾醇与AKT1的结合亲和力最强。使用PyMOL 2.3.0对结合能小于-7 kcal·mol^?1的分子对接结果进行可视化。

一个有趣的观察是，β-谷甾醇与关键靶点的绝对结合能值与其他成分相比更低，表明β-谷甾醇与关键靶点的结合亲和力更强。这表明β-谷甾醇在治疗肾纤维化中起着至关重要的作用。文献表明β-谷甾醇可以抑制肺泡EMT，而PI3K/AKT/GSK3β信号通路是调控EMT的经典通路。因此，我们假设β-谷甾醇作为THSWD的主要成分之一，可能通过调节PI3K/AKT/GSK-3β信号通路抑制EMT，从而改善肾纤维化。

β-谷甾醇给药浓度的筛选

为了确定治疗TCMK1细胞的合适β-谷甾醇浓度并评估其对细胞活力的影响，进行了MTT assay。如图所示，浓度为5、10和20 μmol·L^?1的β-谷甾醇导致更高的吸光度值，表明TCMK1细胞具有更好的细胞活力。然而，在浓度为40、80和100 μmol·L^?1时，吸光度值显著降低，表明β-谷甾醇对TCMK1细胞有抑制作用。与对照组相比，这种降低具有统计学意义（p < 0.001）。因此，本研究选择5、10和20 μmol·L^?1的浓度用于β-谷甾醇处理。

β-谷甾醇改善TGF-β诱导的体外肾纤维化表型

越来越多的证据表明，TGF-β通过促进上皮细胞向成纤维细胞转化，从而诱导肾纤维化，发挥着不可替代的作用。因此，我们选择用TGF-β刺激TCMK1细胞以诱导体外肾纤维化表型进行实验。TGF-β刺激后，治疗组分别给予5、10和20 μmol·L^?1的β-谷甾醇。干预24小时后，使用western blot检测TCMK1细胞中相关蛋白的表达，如图所示。

TGF-β刺激后，纤维化标志物α-SMA和Fibronectin的蛋白水平升高，表明TCMK1细胞发生了纤维化变化。经过β-谷甾醇干预后，纤维化蛋白水平下降，表明β-谷甾醇可以减轻TCMK1细胞的纤维化。

β-谷甾醇调节EMT标志物：Twist和E-cadherin表达

在本研究中，我们通过分析上皮标志物E-cadherin和EMT转录因子Twist来评估β-谷甾醇对TGF-β诱导的EMT的影响。如图所示，TGF-β降低了E-cadherin的表达，但β-谷甾醇部分恢复了其表达，表明β-谷甾醇有助于维持上皮表型。对于Twist，TGF-β处理降低了其表达，但β-谷甾醇治疗组观察到其表达显著增加。因此，β-谷甾醇可以通过恢复E-cadherin和上调Twist来调节TGF-β诱导的EMT，维持上皮表型。

β-谷甾醇抑制EMT相关的间质标志物（N-cadherin和vimentin）

N-cadherin的高表达和Vimentin水平的增加是EMT的标志。因此，我们评估了Vimentin和N-cadherin的蛋白表达水平，以验证β-谷甾醇可以抑制TGF-β诱导的EMT变化。如图所示，TGF-β刺激后，Vimentin和N-cadherin的蛋白表达水平显著增加，表明肾小管上皮细胞发生了EMT，转化为肌成纤维细胞并分泌大量ECM，如Vimentin和N-cadherin，这些物质大量沉积在肾脏中。然而，用β-谷甾醇治疗后，Vimentin和N-cadherin的蛋白表达水平显著降低，证明β-谷甾醇可以抑制TGF-β刺激的TCMK1细胞纤维化模型中的EMT。

β-谷甾醇抑制PI3K/AKT/GSK3β信号通路

PI3K/AKT信号通路直接参与EMT的诱导。肾小管上皮细胞损伤激活PI3K/AKT信号通路，激活的AKT随后激活GSK3β，诱导EMT。因此，我们评估了PI3K/AKT/GSK3β信号通路相关蛋白的表达，以确定β-谷甾醇是否通过该通路调节EMT。如图所示，TGF-β刺激后，磷酸化的PI3K、AKT和GSK3β蛋白水平显著增加。然而，用β-谷甾醇治疗后，磷酸化的PI3K、AKT和GSK3β蛋白水平显著降低，表明β-谷甾醇可能通过调节PI3K/AKT/GSK3β信号通路抑制EMT，从而改善TCMK1细胞的纤维化。

讨论

随着高血压、糖尿病和肥胖发病率的增加，以及人口显著老龄化，CKD患者数量逐年增加，使其成为全球健康问题。肾纤维化是CKD的标志，其特征是肾细胞损伤和ECM过度积累。肾组织损伤后，局部炎症反应激活免疫系统，导致免疫细胞浸润和炎症介质释放。这促进了肌成纤维细胞的激活，导致ECM产生增加和ECM合成与降解失衡，造成大量沉积在肾脏中。随着疾病进展，发生肾小球血管异常增殖和肾小管萎缩，导致瘢痕组织形成，最终破坏肾脏结构和功能。

中医认为“络”是分布于脏腑之间的微细网络，输送“气”、血和津液，连接身体内外。这个概念类似于现代医学中的微血管系统。肾“络”指的是肾脏的毛细血管网络。我们认为肾“络”是肾脏的枢纽，促进气、血和津液的流动，并连接身体的上下部分。当肾脏受损时，“络”脉功能失调导致气和血循环异常，产生痰和血瘀阻塞肾“络”。久病导致“络”“气”阻塞，引起肾营养不良和功能衰竭。基于此，我们提出了活血化瘀、散结的方法来治疗慢性肾功能衰竭。

THSWD是活血通络的经典中药方剂。临床上，THSWD在治疗CKD方面显示出显著疗效。然而，尚无关于其对肾纤维化影响的系统研究。因此，我们利用网络药理学系统报告了其活性成分、靶点和作用机制。

本研究发现THSWD的多种成分具有抗肾纤维化特性，包括β-谷甾醇、山奈酚、槲皮素和豆甾醇。β-谷甾醇是一种天然甾体化合物，具有抗氧化、抗炎和抗凋亡活性。据报道，它通过抑制TNF-α和IL-6的表达，在缺血再灌注诱导的急性肾损伤（AKI）模型中发挥抗炎和抗氧化作用，从而缓解AKI。此外，β-谷甾醇可以抑制凋亡，对抗肺纤维化，并降低CCL4诱导的肝损伤中纤维化标志物的表达。槲皮素是一种黄酮类化合物，具有抗纤维化、抗炎和抗氧化应激特性。它可以抑制ECM分泌、成纤维细胞增殖，并减少炎症细胞浸润，从而对抗肾纤维化。山奈酚是另一种黄酮类化合物，具有抗炎和抗氧化作用，通过抑制ECM分泌改善肾纤维化，并可以通过TGF-β/Smad信号通路对抗肝纤维化。豆甾醇是一种天然植物甾醇，存在于日常食物如大豆和大米中，具有抗氧化和降低胆固醇的特性，广泛用于心血管疾病和各种癌症。这些成分共同发挥抗肾纤维化作用。

GO富集分析表明，THSWD的抗肾纤维化作用主要通过细胞增殖和凋亡等生物过程实现，这与肾纤维化的病理机制一致。KEGG通路富集主要集中于IL-17和PI3K/AKT信号通路。IL-17是一种促炎细胞因子，促进成纤维细胞分泌细胞外基质，影响肾纤维化。PI3K/AKT通路是一条经典的信号通路，研究表明抑制PI3K/AKT通路的激活可以抑制EMT，从而改善肾纤维化。此外，PI3K/AKT参与M2巨噬细胞极化，缓解肾小管间质纤维化。在肺纤维化中，抑制PI3K/AKT通路可以减少炎症反应，下调TGF-β1和PDGF-RB的表达，并限制纤维化细胞的激活。它还通过调节自噬来对抗肺纤维化。PI3K/AKT通路的激活增强肝星状细胞活化、炎症反应和ECM积累，促进肝纤维化。此外，PI3K/AKT通路可以调节自噬并抑制凋亡，从而改善心肌纤维化。因此，THSWD可以通过多种通路抑制肾纤维化，其中PI3K/AKT信号通路在各种器官纤维化中发挥着重要作用。可以合理推测，PI3K/AKT通路是THSWD发挥抗肾纤维化作用的主要信号通路。PPI分析确定ESR1、AKT1、IFNG和IL2是THSWD改善肾纤维化的核心靶点。随后，我们对β-谷甾醇、山奈酚、槲皮素、豆甾醇与这些靶点进行了分子对接。结果显示结合能均小于-4 kcal·mol^?1，表明结合稳定性良好。对分子对接结果的分析显示，所有四种活性成分都与AKT1具有良好的对接效果。AKT1在多种信号通路中发挥抗纤维化作用，例如通过抑制AKT1/GSK3β信号通路改善肾纤维化，通过抑制AKT1/线粒体自噬减少肝纤维化，以及通过诱导炎性细胞因子IL-13的释放来调节肺纤维化。β-谷甾醇与ESR1、AKT1、IFNG和IL2的结合能绝对值高于其他成分。因此，推测β-谷甾醇是THSWD对抗肾纤维化的重要活性成分，主要通过PI3K/AKT信号通路发挥作用。研究表明β-谷甾醇在对抗肝纤维化和肺纤维化方面具有显著效果，但其在肾纤维化中的作用尚未探索。我们的实验结果表明，β-谷甾醇以剂量依赖的方式降低TGF-β刺激的TCMK1细胞中纤维化标志物（α-SMA, fibronectin）和间质标志物（N-cadherin, vimentin）的表达。此外，它还能恢复上皮标志物E-cadherin并上调Twist，从而对上皮-间质转化（EMT）产生有效的抑制作用。尽管先前的研究表明β-谷甾醇可以抑制肺泡上皮细胞的EMT并改善肺纤维化，但其在肾脏中的抗纤维化机制仍未得到充分探索。

EMT是一个关键过程，上皮细胞转分化为产生细胞外基质（ECM）的肌成纤维细胞，由TGF-β通过激活PI3K/AKT/GSK-3β信号通路驱动。PI3K/AKT/GSK-3β的磷酸化通过下调E-cadherin和上调Twist来促进EMT。最近的研究表明，发生EMT的肾小管上皮细胞转化为肌成纤维细胞，这是ECM的主要来源，伴随着间质标志物如N-cadherin和vimentin的表达增加。

在我们的研究中，TGF-β刺激显著增加了TCMK1细胞中N-cadherin