STUB1介导VP1泛素化降解抑制塞内卡病毒A复制的机制及病毒3C蛋白酶的反向调控作用

本研究发现分子伴侣依赖性E3泛素连接酶STUB1通过特异性靶向塞内卡病毒A（SVA）结构蛋白VP1的K177和K260位点，介导其K48连接的多聚泛素化修饰和蛋白酶体降解途径，从而有效抑制病毒复制。值得注意的是，病毒进化出反击策略：SVA 3C蛋白酶（3Cpro）通过酶活依赖性方式降解STUB1，解除其对VP1的降解作用。该研究揭示了宿主-病毒博弈的新机制，为抗SVA药物研发提供了潜在靶点。

　　

STUB1与SVA VP1蛋白相互作用

塞内卡病毒A（SVA）是一种引起猪水疱性疾病的重要病原体，对全球养猪业造成显著经济损失。该研究通过免疫共沉淀联合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术筛选与SVA VP1蛋白相互作用的宿主蛋白，发现分子伴侣依赖性E3泛素连接酶STUB1（STIP1 homology and U-box-containing protein 1）与VP1存在特异性结合。正向和反向免疫共沉淀实验证实了GFP-VP1与HA-STUB1在HEK-293T细胞中的直接相互作用。共聚焦显微镜观察进一步显示，在SVA感染的BHK-21和ST细胞中，外源表达的HA-STUB1和内源性STUB1均与病毒VP1蛋白发生显著共定位。更重要的是，在病毒感染情况下，使用抗VP1抗体进行免疫共沉淀，确实能够沉淀出内源性STUB1蛋白，证实了这种相互作用在生理条件下的真实性。

STUB1负调控SVA复制

为探究STUB1对病毒复制的功能影响，研究者在BHK-21和ST细胞中过表达STUB1，随后感染SVA。结果显示，过表达STUB1显著降低了病毒VP1蛋白的表达水平，并在感染后6小时和12小时均导致病毒滴度（TCID₅₀）显著下降。利用表达增强型绿色荧光蛋白（eGFP）的重组病毒（rSVA-eGFP）进行感染性实验，发现随着HA-STUB1表达量的增加，表达eGFP的病毒阳性细胞数量逐渐减少，直观地证明了STUB1对病毒感染的抑制作用。相反，通过小干扰RNA（siRNA）敲低细胞内源性STUB1表达后，病毒VP1蛋白水平和病毒滴度均显著升高。这些功能获得和功能缺失实验一致证明，STUB1是SVA复制的关键负调控因子。

VP1的K177和K260位点是STUB1介导的泛素化依赖性降解所必需的

研究者假设STUB1通过促进VP1降解来限制病毒复制。实验表明，STUB1以剂量依赖的方式降低GFP-VP1的蛋白水平，而不影响对照载体GFP-C1。放线菌酮（CHX）追踪实验证明，过表达STUB1加速了GFP-VP1的降解，而敲低STUB1则稳定了VP1蛋白。通过使用蛋白酶体抑制剂MG132和自噬抑制剂氯喹（CQ）进行处理，发现MG132能有效挽救STUB1介导的VP1降解，而CQ则无此效果，表明STUB1主要通过泛素-蛋白酶体途径降解VP1。免疫共沉淀实验证实VP1可被泛素化修饰，且STUB1以剂量依赖的方式增强VP1的泛素化水平。进一步使用仅保留K48或K63位点的泛素突变体进行实验，发现STUB1特异性地催化VP1发生K48连接的多聚泛素化，这种修饰通常靶向底物至蛋白酶体进行降解。通过生物信息学预测和点突变实验，研究者将STUB1介导的泛素化位点精确定位到VP1蛋白的第177位和260位赖氨酸残基（K177和K260）。只有当VP1保留K177或K260单个位点时，STUB1才能介导其泛素化和降解；同时突变这两个位点（双突变体）则完全阻断了STUB1对VP1的调控。回补实验证明，外源表达VP1能够逆转STUB1对病毒复制的抑制作用。

热休克蛋白70（HSP70）或热休克蛋白70同源蛋白（HSC70）对STUB1介导的VP1降解至关重要

STUB1的功能依赖于其分子伴侣结合活性和E3泛素连接酶活性。研究者构建了STUB1的两种功能缺失突变体：K30A突变体（破坏分子伴侣结合所需的TPR结构域）和H260Q突变体（破坏U-box结构域的E3连接酶活性）。这两种突变体均失去了降解VP1的能力。免疫共沉淀分析揭示，K30A突变破坏了STUB1与VP1、HSP70及HSC70的相互作用，而H260Q突变仅影响其酶活，不影响结合能力。这表明分子伴侣HSP70/HSC70在STUB1与VP1之间起到了桥梁作用。过表达HSP70或HSC70增强了STUB1与VP1的结合，并促进了STUB1介导的VP1降解；相反，敲低这些分子伴侣则削弱了该过程。重要的是，HSP70/HSC70无法增强STUB1-K30A突变体对VP1的降解，证实了其功能依赖于STUB1的分子伴侣结合能力。在病毒复制实验中，STUB1-K30A和H260Q突变体均丧失了 antiviral 活性。

SVA感染下调STUB1表达

尽管HSP70/HSC70在体外促进STUB1介导的VP1降解，但过表达这些分子伴侣却意外地促进了SVA的复制，这与它们作为病毒复制促进因子的既往报道一致。为解决这一悖论，研究者检测了病毒感染过程中这些蛋白的表达动态。发现SVA感染后，STUB1蛋白水平显著下降，而HSP70和HSC70水平保持不变。这种下调依赖于病毒的活跃复制，因为紫外线灭活的病毒无法引起STUB1减少。值得注意的是，STUB1的mRNA水平并未发生变化，提示其调控发生在蛋白质翻译后水平。机制上，STUB1是HSP70/HSC70介导的VP1降解所必需的，因为敲低STUB1后，HSP70/HSC70无法再促进VP1降解。这表明，SVA通过主动下调STUB1的表达，巧妙地解除了HSP70/HSC70介导的抗病毒防御，并将其转化为有利于病毒复制的因子。

SVA 3C蛋白酶通过降低STUB1表达来拮抗STUB1介导的VP1降解

为寻找负责下调STUB1的病毒因子，研究者系统测试了SVA各病毒蛋白的表达对STUB1水平的影响。发现只有病毒3C蛋白酶（3Cpro）的表达能够以剂量依赖的方式降低内源性STUB1和外源表达的HA-STUB1蛋白水平。研究者还测试了其他小RNA病毒的3Cpro，发现塞内卡病毒、口蹄疫病毒（FMDV）和人鼻病毒（HRV）的3Cpro也能降低STUB1，而柯萨奇病毒B3（CVB3）、脑心肌炎病毒（EMCV）和肠道病毒71型（EV71）的3Cpro则无此功能，表明这种调控具有一定病毒特异性。关键的是，蛋白酶活性是3Cpro降解STUB1所必需的：当引入破坏其催化位点的点突变（H48A、C160A及双突变DM）后，3Cpro失去了下调STUB1的能力。功能上，野生型3Cpro，而非蛋白酶失活突变体（DM），能够有效拮抗STUB1介导的VP1降解，其机制正是通过特异性降低STUB1的蛋白水平来实现的。

SVA突变体的复制能力在体外和体内增强

鉴于小鼠与猪STUB1蛋白的高度序列同源性，研究发现小鼠STUB1（mSTUB1）同样能够抑制SVA复制并降解VP1。为探究K177和K260在病毒复制中的功能，研究者利用反向遗传学系统成功拯救了VP1-K260R单点突变病毒，但无法获得VP1-K177R突变病毒，提示K177位点对病毒存活至关重要。体外实验表明，rSVA-VP1-K260R形成的噬斑更大，病毒生长曲线滴度更高，证明其复制能力增强。在小鼠感染模型中，与感染野生型病毒的小鼠相比，感染rSVA-VP1-K260R突变病毒的小鼠在心脏、肝脏、脾脏、肾脏和肺组织中均表现出更高的病毒载量。组织病理学分析进一步显示，突变病毒感染引起了更严重的肺部病变，包括肺泡壁增厚、局灶性粒细胞浸润和代偿性肺泡扩张伴肺泡间隔增宽。这些结果综合证明，VP1-K260位点的突变使病毒能够逃避STUB1介导的宿主防御，从而增强了其在体内的复制能力和致病性。

讨论与总结

该研究深入揭示了STUB1作为一种新型宿主限制因子，通过泛素-蛋白酶体途径降解SVA主要衣壳蛋白VP1来抑制病毒复制的分子机制。其核心在于STUB1特异性识别并催化VP1蛋白K177和K260位点发生K48连接的多聚泛素化修饰。分子伴侣HSP70和HSC70通过增强STUB1与VP1的相互作用，正调控这一过程。然而，病毒在与宿主的共进化中发展出了有效的反击策略：其3C蛋白酶利用其蛋白酶活性降解STUB1，从而解除宿主对VP1的降解作用，颠覆了宿主的抗病毒防御。体内外功能实验证实，逃逸STUB1介导的降解（K260R突变）的病毒突变体表现出增强的复制能力和致病性。该研究不仅揭示了STUB1-VP1-3Cpro轴在SVA感染中的核心调控作用，为理解宿主-病毒相互作用提供了新范式，也为开发针对SVA及其他小RNA病毒的新型治疗策略（如靶向STUB1-VP1相互作用或抑制3Cpro酶活）提供了重要的理论依据和潜在的分子靶点。