异烟肼药敏检测差异的遗传机制解析：基于中国湖南地区MGIT 960耐药而MTBDRplus敏感结核分枝杆菌株的全基因组研究

本研究系统分析了中国湖南地区53株经Bactec MGIT 960系统（MGIT）判定为异烟肼（INH）耐药、但GenoType MTBDRplus（MTBDRplus）检测显示敏感的结核分枝杆菌。通过最小抑菌浓度（MIC）测定和全基因组测序（WGS）技术，发现仅有少数菌株携带WHO突变目录中明确与耐药相关的变异（Group 1/2），而绝大多数菌株携带“临床意义未明”（Group 3）的变异，广泛分布于katG、ahpC、inhA等9个基因中。研究强调了表型与基因型药敏检测（DST）结果差异的遗传复杂性，呼吁将高通量测序技术整合进现有诊断体系以提高INH耐药检测准确性。

　　

ABSTRACT

异烟肼（INH）药敏检测中Bactec MGIT 960系统（MGIT）与GenoType MTBDRplus检测（MTBDRplus）的结果不一致，给临床决策带来挑战。本研究对53株经MGIT判定为INH耐药但MTBDRplus显示敏感的结核分枝杆菌菌株进行了最小抑菌浓度（MIC）测定和全基因组测序（WGS），并依据WHO突变目录评估了导致INH耐药的变异类型。结果显示，仅5株菌携带明确“与耐药相关”（Group 1/2）的变异，包括katG Trp39STOP、katG Ser315Asn、inhA ?154G>A和inhA Ser94Ala。此外，44株菌在9个基因（katG、ahpC、inhA、Rv0010c、Rv1129c、Rv2752c、mshA、dnaA和Rv1258c）中检出70个属于“第三类：临床意义未明”（Group 3）的变异。其余4株未发现与INH耐药明确相关的变异。谱系2与谱系4菌株在高水平INH耐药发生率上无显著差异（χ2 = 0.232，P = 0.630）。本研究提示，“临床意义未明”的变异可能是导致药敏结果差异的主要遗传决定因素，其与INH耐药的关系亟需进一步研究。

IMPORTANCE

本研究直面药敏检测（DST）中的关键难题：MGIT与MTBDRplus在INH药敏判断中的不一致性。这种差异严重干扰治疗决策，可能导致患者预后不佳。借助MIC测定和WGS技术，我们深入探索了53株临床结核分枝杆菌菌株中INH耐药的遗传基础。结果表明，仅极少数菌株携带明确耐药相关变异，而更多菌株含有多个基因中意义未明的变异，凸显了INH耐药机制的复杂性。本研究强调，亟需深化对这些“第三类：意义未明”变异的认识，它们很可能是导致检测差异的主要原因。此外，研究也表明，将先进测序工具整合进DST对提升INH耐药检测准确性具有重要意义。

INTRODUCTION

异烟肼（INH）因其强早期杀菌活性，成为一线抗结核治疗的基石药物，然而其耐药性在全球日益加剧。无论单独出现还是与其他药物联合耐药，INH耐药已成为最普遍的抗结核药物耐药形式。全球监测数据显示，1994–2009年间各地INH耐药流行率差异显著，西欧/中部非洲为14%，东欧则高达30%。2003–2017年，全球新发结核病例中INH耐药、利福平敏感结核（Hr-TB）的患病率为7.4%，既往治疗病例中为11.4%。中国东部一项回顾性研究（2013–2018年）进一步证实Hr-TB的临床意义，其在结核患者中流行率达4.6%。鉴于INH耐药结核较药物敏感结核治疗效果更差，快速准确检测INH耐药对结核病管理至关重要。

Bactec MGIT 960系统（MGIT）和Genotype MTBDRplus assay（MTBDRplus）是WHO推荐的结核实验室常用药敏检测方法。MGIT作为表型药敏检测（pDST）方法，是检测INH耐药的参考标准，但耗时长、操作繁复。相比之下，MTBDRplus作为基因型药敏检测（gDST）方法，通过识别katG基因及inhA基因启动子区变异，可快速检测INH耐药，特异性高（>95%），但敏感性多变（75%–94%）。这些差异可能导致两种检测结果不一致，挑战临床决策。例如，MTBDRplus可能提示INH敏感，而MGIT检测为耐药，造成解读冲突。

MTBDRplus与MGIT之间的差异可能源于多种因素。首先，MTBDRplus检测katG基因和inhA启动子区中与INH耐药相关突变，但某些位于这些区域、导致耐药的变异未被MTBDRplus探针覆盖，可能导致假敏感结果。此外，在INH异质耐药情况下，患者体内同时存在INH敏感和INH耐药结核分枝杆菌（MTB）混合群体，传统药敏检测仍是检测异质耐药最敏感的方法，而MTBDRplus在检测1%阈值以上的耐药亚群时缺乏足够的分析敏感性。

尽管既往研究已探讨pDST与gDST在检测INH耐药中的不一致性，但对MGIT报告耐药而MTBDRplus显示敏感的菌株，其遗传决定因素仍不完全清楚。因此，本研究旨在整合临床数据、MIC检测和全基因组测序，深入探索导致这些差异的遗传机制，有望揭示新的遗传决定因素。

MATERIALS AND METHODS

Study design

2014年10月至2021年9月期间，纳入经MGIT培养阳性、且先前经MGIT判定为INH耐药但MTBDRplus检测为INH敏感的结核病例。收集相关社会人口学和临床数据，包括性别、年龄、治疗史、感染部位和生物样本。同一患者分离出多个MTB菌株时，仅纳入研究期间首次分离的菌株。所有菌株于含10%甘油的胰蛋白酶大豆肉汤中-80°C保存。为确保准确性，所有菌株均经MGIT和MTBDRplus重新进行药敏确认，随后进行WGS和MIC检测，以探究结果差异的机制。

DST by MGIT

采用Middlebrook 7H10培养基上的细菌生长物制备接种物。36 ± 1°C培养约21天后，收集新鲜菌落，转移至含玻璃珠和100 μL 0.05% Tween 80的无菌瓶中。涡旋30秒分散菌块，悬浮于3 mL生理盐水中。静置10–15分钟后，取上清0.5 mL测定菌液浓度，调整至0.5麦氏浊度，并以生理盐水进行1:5稀释。制备好的接种物按照Bactec MGIT 960 SIRE试剂盒（Becton, Dickinson and Company, USA）说明书进行MGIT INH药敏检测，临界INH浓度为0.1 μg/mL。每批次检测以MTB H37Rv（ATCC 27294）进行质控。

DST by MTBDRplus

对复苏的MTB菌株按照制造商说明（Hain Lifescience, Germany）进行MTBDRplus检测。流程包括DNA提取、主混合物制备、多重PCR扩增和反向杂交。实验全程使用无菌无核酸酶水作为阴性对照，各步骤于独立房间进行以防交叉污染。所有预期对照条带出现则结果有效，否则无效。某个耐药相关基因野生型条带缺失或出现变异条带提示该抗生素耐药；反之，某基因所有野生型探针显色且未检出变异，则判定菌株对该抗生素敏感。

MIC

采用Middlebrook 7H9肉汤微稀释（BMD）板进行INH的MIC测定，遵循WHO指南。每株菌在BMD板上重复测试，以MTB H37Rv为对照。简要而言，复苏菌株从Middlebrook 7H10培养基收获，悬浮于含玻璃珠的盐水-Tween中振荡，上清浊度标准化至0.5麦氏单位。菌悬液以含10% OADC的Middlebrook 7H9肉汤进行1:100稀释。取100 μL混合物加入含干燥INH（BASO Company, China）的96孔细胞培养板中。INH在Middlebrook 7H9中的浓度梯度为0.03至16.0 μg/mL。每株菌质控包括1孔阴性生长对照和2孔阳性对照（0.5麦氏标准悬液的100%和1%接种量）于无药对照孔中。极板用塑料盖密封，37°C环境空气培养7–21天。当1%和100%对照孔可见生长而阴性对照无生长时读数。MIC定义为无肉眼可见生长的最低药物浓度。MIC ≥ 1 μg/mL的菌株被归类为高水平INH耐药，MIC在0.125–0.5 μg/mL（含）的菌株被归类为低水平INH耐药。

WGS and bioinformatics analysis

使用细菌DNA提取试剂盒（Gene-Optimal, 60300K-50 T）进行基因组DNA提取和纯化。所有WGS由上海晶诺生物科技有限公司完成。采用FS DNA Library Prep Kit V6（RK20259）在Illumina平台上制备DNA文库。索引文库合并后按制造商说明（Illumina, USA）加载至Illumina HiSeq仪器。经文库质控后，在Illumina NovaSeq 6000平台上进行PE150测序。使用Fastp（v0.20.0）过滤原始FASTQ序列，去除接头、重复读段和低质量读段。清洁读段通过BWA（v0.7.17）和SAMtools（v1.7）比对至MTB H37Rv参考基因组（NC_000962.3）。使用Freebayes（v1.3.2）调用单核苷酸多态性（SNPs），最低覆盖度为10读段，作图质量值≥100。采用内部脚本提取SNP序列并计算样本间配对距离。使用snippy-core插件（v4.4.3）屏蔽短串联重复基因（如PE/PPE）后获取核心基因组。通过Gubbins（v2.4.1）进行多序列比对，随后利用IQ-TREE（v2.1.4）重建最大似然（ML）系统发育树。通过与WHO突变目录比对，初步鉴定INH耐药相关变异。使用TB-Profiler（v6.3.0）分析BAM文件，识别WHO目录未收录的额外耐药相关变异及菌株谱系。

Statistical analysis

所有统计分析使用IBM SPSS（version 20.0）完成。采用Pearson卡方检验评估菌株谱系与耐药水平间的关联。此外，采用独立双尾Student t检验分析遗传变异数量与耐药水平的关系。P值小于0.05视为有统计学意义。

RESULTS

Patient demographics

在102例经MGIT判定为INH耐药但MTBDRplus显示敏感的患者中，最终纳入53例进行分析，包括男性41例（77.4%）和女性12例（22.6%），中位年龄52岁（四分位距：46–62岁）。其中5例（9.4%）为新发病例，48例（90.6%）为复治病例。40例（75.5%）为耐多药结核病（MDR-TB）。49株（92.5%）菌分离自痰样本，其余4株（7.5%）来自支气管肺泡灌洗液。49例患者因多种原因被排除研究。

Lineage and genetic distance based on WGS

基于53株MTB菌株WGS的系统发育分析显示，存在2个主要谱系：谱系2和谱系4。35株（66.0%）属于优势谱系2（主要为东亚型），包括31株（58.5%）亚谱系2.2.1和4株（7.5%）亚谱系2.2.2。18株（34.0%）属于谱系4（主要为欧美型），包括1株（1.9%）亚谱系4.2.2、7株（13.2%）亚谱系4.4.2、1株（1.9%）亚谱系4.4和9株（17.0%）亚谱系4.5。

配对遗传距离分析以少于12个SNPs为阈值，将6株菌分为3个簇（簇集率11.3%）。所有簇集菌株均属于谱系2。簇集菌株中，2株分离自新发结核患者，4株来自既往治疗患者。

MIC distribution

53株菌的INH中位MIC为1 μg/mL。27株（50.9%）观察到高水平INH耐药（MIC ≥1 μg/mL），其中13株MIC超过16 μg/mL。具体而言，谱系2菌株中位MIC为0.5 μg/mL，17株（48.6%）表现为高水平耐药；谱系4菌株中位MIC为1 μg/mL，10株（55.6%）为高水平耐药。两谱系在高水平INH耐药发生率上无显著差异（χ2 = 0.232，P = 0.630）。

Variants associated with INH resistance in 53 strains

共鉴定出83个与INH耐药相关的变异，分布于9个基因（katG、ahpC、inhA、Rv0010c、Rv1129c、Rv2752c、mshA、dnaA和Rv1258c）。83个变异中，除katG Val1Ala外，其余82个均收录于WHO目录。这些变异分类如下：2个（katG Ser315Asn和inhA ?154G>A）属于Group 1，2个（katG Trp39STOP和inhA Ser94Ala）属于Group 2，73个属于Group 3，1个属于Group 4，4个属于Group 5。

53株菌中，仅5株携带“与耐药相关”（Group 1和2）的变异，包括katG Trp39STOP、katG Ser315Asn、inhA ?154G>A和inhA Ser94Ala。katG Trp39STOP和katG Ser315Asn的出现频率分别为98.8%和42.0%。此外，44株菌携带70个分类为“意义未明”（Group 3）的变异。剩余4株缺乏Group 1–3的变异，仅携带分类为“与耐药无关”（Group 4和5）的变异。

DISCUSSION

本研究探讨了导致临床MTBC菌株中INH表型与基因型药敏检测结果差异的遗传决定因素。结果显示，53株菌在9个INH耐药相关基因中存在83个变异，但仅5株携带WHO目录Group 1和2中的变异（katG Ser315Asn、katG Trp39STOP、inhA ?154G>A和inhA Ser94Ala），这些应被视为具有临床意义的表型INH耐药标志物。需注意的是，包括katG Ser315Asn在内的这些变异均未被MTBDRplus探针覆盖，这可能是导致pDST与gDST结果差异的原因。

在44株缺乏Group 1和2变异、但携带WHO目录Group 3变异的菌株中，2株（32134和69442）还携带了katG Val1Ala变异（未收录于WHO目录但见于TB-Profiler）。该变异位于KatG的N末端，可能降低KatG水平和过氧化物酶活性。由于INH是前药，需经KatG激活，推测低水平KatG可能导致表型INH耐药。

既往研究表明，INH耐药主要与katG、inhA及其启动子区、ahpC及其启动子区的变异相关。本研究中44株菌大多携带这些基因或其启动子区的变异。值得注意的是，katG基因和ahpC启动子区变异频率最高，但这些变异与表型INH耐药的关系基于当前WHO突变目录仍不明确。需进一步研究阐明这些变异，特别是katG和ahpC启动子区变异在介导INH耐药中的作用。

2007年中国全国耐药结核病调查显示，ahpC-oxyR基因间区突变在INH耐药菌株中占18.6%，其中85.7%的菌株同时携带katG或其他基因的额外突变。尽管如此，ahpC-oxyR基因间区突变在INH耐药机制中的潜在区域意义仍需重视。然而，MTBDRplus等广泛应用的分?检测仅限于检测katG和inhA基因变异，不包括ahpC。本研究强调了检测ahpC变异的潜在价值，并提示可检测ahpC变异的MeltPro TB检测可能是在中国准确识别INH耐药更全面、更合适的检测方法。

除这些明确特征的变异外，其他基因（如efpA、fadE24、kasA、nat、dnaA、Rv0010c、mshA、hadA、Rv1129c、Rv1258c、ndh、Rv2752c和glpK）中的变异也被发现与INH耐药相关。尽管部分基因的具体生物学功能尚未完全阐明，推测它们可能通过影响药物代谢、改变药物靶标、修饰细胞壁合成等途径影响INH耐药或耐受。例如，参与分枝菌酸生物合成的kasA基因变异可减少INH与靶标结合，导致耐药；编码NADH脱氢酶的ndh基因变异可能通过抑制KatG对INH的激活，导致耐受。本研究中检测到mshA、dnaA、Rv0010c、Rv1129c、Rv1258c和Rv2752c中的变异，提示它们可能参与INH耐药通路。

结果显示，菌株常携带多个INH耐药相关变异，并鉴定出15个特定变异（如katG Arg463Leu）同时存在于高、低水平INH耐药菌株中，这种重叠使得难以区分 specifically 导致高或低水平耐药的变异。既往研究提示，katG、inhA和ahpC等基因变异的积累可能与INH耐药水平升高相关。然而，本研究采用t检验比较高、低水平INH耐药菌株的变异数量，未显示统计学显著差异（t = 0.231，P = 0.818）。需注意，本研究中的耐药水平通过MIC检测方法量化，并非旨在验证表型DST分类。例如，6株INH MIC为0.125 μg/mL的菌株（20330、25707、25949、28802、30918和78704）经MGIT 960检测为表型耐药，但依据WHO推荐的临界浓度基于MIC检测则判为敏感，这种差异可能反映了两种检测方法固有的方法学差异。

当前分子方法检测异质耐药的敏感性有限，如MTBDRplus检测要求耐药亚群超过5%才能可靠识别，使得异质耐药成为导致pDST与gDST差异的关键因素。本研究WGS显示18株菌（34.0%）中存在21个变异，其频率在10.8%至99.0%之间，表明该群体中异质耐药普遍存在。然而，在72043菌株中，测序显示katG Ser315Asn变异频率为42%，但MTBDRplus检测未检出INH耐药，这种差异更可能反映了检测的技术局限性而非真实异质耐药。这些发现凸显了需要更敏感的诊断工具以准确检测临床菌株中的异质耐药。

结果还显示，6株菌遗传距离少于12个SNPs，提示近期传播。然而，流行病学调查和病例访谈未确认这些个体间存在直接传播链。值得注意的是，4个变异（katG Arg463Leu、Rv1129c ?28T>C、Rv1258c Glu194fs和mshA Ala187Val）仅存在于谱系2菌株中。这种谱系特异性分布提示谱系2与谱系4群体间存在 distinct 遗传适应和选择压力。

本研究存在若干局限性。首先，单中心设计和相对较小的样本量可能限制结果的普适性。其次，分析聚焦于WHO变异目录收录的基因，可能导致遗漏其他耐药机制，如外排泵过度表达（如Rv1218c）。最后，尽管WGS鉴定出多个耐药相关变异，但这些变异间的功能相互作用尚不明确，需通过基因敲除和回补研究进一步探讨。

总之，本研究揭示，“第三类：意义未明”的变异可能是导致INH药敏检测结果差异（MGIT耐药而MTBDRplus敏感）的主要遗传决定因素，强调了它们与INH耐药的关系亟需深入研究。此外，本研究强调了将先进测序工具整合进药敏检测对提高INH耐药检测准确性的重要性，最终有助于优化临床决策、支持全球抗击耐药结核病。

ACKNOWLEDGMENTS

本研究获得湖南省自然科学基金（2022JJ70011, 2023JJ30334）和湖南省临床医疗技术创新引导项目（2021SK50702）资助。资助方在研究设计、数据收集与分析、文章撰写或发表决定中无任何角色。