澳大利亚流行性百日咳鲍特菌生物膜细胞的蛋白质组学比较揭示菌株特异性变异

本研究通过比较澳大利亚流行的百日咳鲍特菌（Bordetella pertussis）单核苷酸多态性（SNP）簇I（ptxP3）和簇II（ptxP1）菌株的生物膜形成能力和蛋白质组差异，发现簇I菌株具有更致密的生物膜结构，且能量代谢相关蛋白（如PetABC和BP3650）显著上调。研究强调了尽管该物种基因组高度保守，但生物膜条件下蛋白质丰度存在显著的菌株特异性变异，这为理解当前流行菌株的适应性进化提供了新视角。

　　

ABSTRACT

百日咳鲍特菌（Bordetella pertussis）是引起百日咳这种严重呼吸道传染病的病原体。以往研究主要针对浮游状态的当前优势单核苷酸多态性（SNP）簇I（百日咳毒素启动子等位基因ptxP3）和先前优势簇II（ptxP1）菌株进行比较。由于生物膜形成与百日咳鲍特菌的体内致病性相关，本研究比较了簇I和簇II代表性菌株的生物膜形成能力。共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察发现，簇I菌株比簇II菌株具有更致密的生物膜结构。随后，利用串联质谱标记（TMT）和高分辨率多反应监测（MRM-hr）技术比较了生物膜细胞中蛋白质的丰度差异。总共鉴定到1,453种蛋白质，其中40种蛋白质在两种菌株的生物膜条件下存在显著差异。特别令人关注的是，簇I菌株中能量代谢蛋白（细胞色素蛋白PetABC和BP3650）的丰度大幅增加。当对来自每个簇的另外六株菌进行这些蛋白质的丰度比较时，发现所有菌株间的蛋白质丰度都存在差异。这些发现表明，尽管该物种的基因组高度保守，但不同百日咳鲍特菌菌株在生物膜条件下存在很大程度的个体蛋白质组多样性。总之，本研究揭示了百日咳鲍特菌菌株间生物膜结构的视觉差异，并强调了蛋白质丰度的菌株特异性变异主导了潜在的簇特异性变化，这些变化可能与簇I菌株的优势地位有关。

IMPORTANCE

百日咳鲍特菌引起百日咳。当前流行的簇I菌株已经取代了先前占主导地位的簇II菌株。了解这一进化背后的原因对于制定针对该病原体的新策略至关重要。最近的研究表明，百日咳鲍特菌在感染过程中可以形成生物膜。本研究比较了簇I和簇II菌株的生物膜形成能力，并确定了生物膜的视觉差异。比较了在生物膜中生长的这些菌株之间的蛋白质丰度，并用来自每个簇的额外菌株测量了鉴定出的丰度变化的蛋白质。研究发现，尽管该物种的遗传高度保守，但额外菌株间的蛋白质丰度存在差异。这项研究强调，在生物膜条件下，蛋白质丰度的菌株特异性变异可能主导了与簇I菌株优势地位相关的簇特异性变化。

INTRODUCTION

百日咳（Pertussis）是由百日咳鲍特菌引起的一种严重呼吸道感染。尽管全球疫苗接种广泛，但全球范围内都观察到百日咳病例的重新抬头（1-3）。导致重新抬头的因素之一是进化出适应性更强且与疫苗等位基因类型不匹配的菌株（3, 4）。在澳大利亚，20世纪50年代引入了全细胞疫苗，但由于其反应原性，随后在2000年被无细胞疫苗（ACV）取代（5）。百日咳鲍特菌是一个同质性物种，在单核苷酸多态性（SNP）方面遗传多样性水平较低（6-8）。先前的基因分型研究根据65个SNP将全球百日咳鲍特菌种群分为6个SNP簇（I-VI），并进一步分为42个SNP谱（7）。我们的研究表明，属于含有百日咳毒素启动子ptxP3等位基因的SNP簇I的菌株已经取代了先前占主导地位的含有百日咳毒素启动子ptxP1等位基因的SNP簇II菌株（7）。进一步的SNP簇I菌株全基因组测序将该簇分为六个“流行谱系”（EL 1-6），这些谱系是2008-2012年和2014-2017年澳大利亚疫情暴发的原因（9）。有趣的是，使用小鼠模型的研究表明，无论宿主的免疫状态如何，簇I菌株都比簇II菌株具有更强的适应性，这表明除了与ACV的抗原不匹配之外，可能还存在其他变化，使得簇I菌株的适应性增强（10）。

转录组学研究表明，ptxP3和ptxP1菌株之间存在大量表达改变的基因（4）。发现了毒力因子的主要变化，包括百日咳毒素产量的增加，并假设这增加了小鼠体内的定植（4, 11）。此外，蛋白质组学研究已经确定了SNP簇I和SNP簇II菌株之间发生的其他变化（12-14）。在浮游细胞及其分泌组中，已鉴定出与免疫逃避、毒力和代谢相关的蛋白质丰度变化（13）。关键的是，发现簇I菌株中3型分泌系统蛋白质的分泌减少，这可能与从3型分泌系统等位基因bscI1变为bscI3有关（9, 12, 13）。这些额外的变化可能与在簇I菌株中观察到的适应性增强有关。

最近的研究表明，生物膜在百日咳鲍特菌的致病机制中起着关键作用（15, 16）。生物膜是被包裹在基质内的细胞群落，生物膜内的细胞已被证明对抗菌剂和环境压力更具抵抗力（17-19）。百日咳鲍特菌已被证明能在小鼠模型的上呼吸道体内形成生物膜，而缺乏形成生物膜能力的菌株定植效果较差（15, 20, 21）。此外，生物膜形成能力的增强与定植能力的增强有关（20）。与20世纪50年代分离的Tohama I参考菌株相比，临床百日咳鲍特菌分离株已被证明能形成更多的生物膜（17, 22, 23）。这些研究证明生物膜是百日咳鲍特菌致病机制的一个重要方面。

先前的研究已经确定了在浮游条件下簇I ptxP3和簇II ptxP1菌株之间的表达差异（4, 11-13, 24）。然而，已知生物膜中的细胞在表型上与其浮游对应物不同，转录组和蛋白质组谱发生重大变化（17, 23, 25-29）。因此，比较簇I和簇II菌株在生物膜条件下的情况可能会为了解簇I菌株的适应性和百日咳鲍特菌的重新出现提供更多见解。本研究检查了簇I和簇II生物膜之间的生物膜形成能力和蛋白质组变化，以确定可能有助于解释簇I菌株适应性增强的变异。

MATERIALS AND METHODS

菌株和生长条件

本研究中使用的菌株列于表1。本研究中的所有菌株均为百日咳杆菌粘附素（Pertactin）阳性，因为我们想比较当前的簇I菌株是否由于生物膜差异而具有增加的适应性，且这种差异与百日咳杆菌粘附素失活无关。临床分离株L1423和L1191分别用作SNP簇I和SNP簇II的代表。这两种菌株先前均已被测序并用于小鼠模型的比较感染研究和浮游条件下的蛋白质组学研究（10, 13）。用于确认簇内变化的额外菌株均来自不同年份，但根据Octavia等人的定义（7）被分类为相同的SNP谱（SP）。所有簇I菌株均来自2008-2010年澳大利亚疫情暴发期间的SP13，而簇II中的所有菌株均为SP39，时间跨度为2000年至2006年，L1191除外（表1）。L1191是在与簇I菌株相同的2008-2010年流行期间分离的，而额外的簇II菌株是在流行前时期分离的，因为自2008年以来流行性簇II菌株的发生很少见。

百日咳鲍特菌菌株在Bordet-Gengou（BD Scientific）琼脂上于37°C培养3-5天。对于液体培养，将一环纯的Bvg⁺菌落悬浮于20 mL THIJS培养基（30）中，该培养基补充了heptakis [(2,6-O-二甲基) β-环糊精]和1% THIJS补充物，并在37°C、180 rpm摇动培养24小时。

共聚焦激光扫描显微镜

使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）来识别随时间发生的结构变化并确定生物膜的成熟度。对来自簇I（L1423）和簇II（L1191）的两个代表性菌株进行了显微镜检查。使用了先前建立的方案，并做了微小改动（31）。简而言之，将上述液体培养物调整至OD₆₀₀为0.1/mL，并接种到24孔聚苯乙烯组织培养板（Corning）中，孔底放置12毫米圆形无菌玻璃盖玻片（Livingstone，厚度：1号）。将板以45°角倾斜放置，以便液-气界面位于盖玻片上。将板静态培养5小时以使细胞附着，然后更换培养基（25, 26）。将板在37°C下进一步培养24、48、72和96小时，并以60 rpm轻度振荡（32）。在每个时间点，用1× PBS洗涤孔三次，并小心地从孔中取出盖玻片。用4%多聚甲醛固定生物膜，并用SYTO 9荧光染料（Thermo Fisher Scientific）染色。在Olympus FluoView FV1200共聚焦显微镜上采集Z-stack图像。每个样品随机选择三个视野。每个覆盖84.48 × 84.48 μm表面积的视野用Z-stacks（0.42 μm/片）成像。所有图像均使用60×物镜（油浸，NA 1.35；Olympus）成像。使用ImageJ（版本2.8.0）上的COMSTAT2（版本2.1）插件计算生物膜的生物量、表面积和最大厚度（33）。每个菌株每个时间点进行三个生物学重复。

生物膜蛋白质提取

使用了先前建立的从百日咳鲍特菌细胞中提取蛋白质的方法（13, 27），并做了微小改动。简而言之，将24小时液体培养物（如上所述）接种到聚苯乙烯24孔组织培养处理板（Corning）的所有孔中。每个板代表一个单独的生物学重复，每个菌株进行七个生物学重复。将板在37°C静态培养5小时以允许细胞附着，然后更换培养基。然后将板在60 rpm摇动下再培养96小时。在96小时时，移除上清液，并用无菌1× PBS洗涤孔三次。加入裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl，0.4 mM苯甲基磺酰氟（PMSF）和2 mM EDTA）以灭活蛋白酶。将板在37 kHz水浴超声处理2分钟以 detached 生物膜细胞。将每个单独板的所有孔中的样品合并，离心，并重悬于裂解缓冲液中。然后对样品进行探针超声处理，并使用Luu等人先前描述的方法（13, 27）提取蛋白质。使用Qubit Fluorometer（Thermo Fisher Scientific）定量蛋白质浓度。

蛋白质消化和TMT标记

对于串联质谱标记（TMT），每个重复取100 μg蛋白质，按照Luu等人先前描述的方法（34）用二硫苏糖醇（DTT）还原，用碘乙酰胺（IAA）烷基化，并进行胰蛋白酶消化。使用Empore高性能萃取磁盘柱（3M）清理样品。清理后，按照制造商方案（Thermo Fisher Scientific）使用TMT10plex和TMT6plex标签对样品进行标记。考虑到每个菌株有七个生物学重复，分别使用了10plex和6plex试剂盒。在两个实验中都包含了包含所有样品的混合参考样本作为归一化的参考。用TMT标记肽段后，使用苯乙烯二乙烯基苯阶段吸头（styrene divinylbenzene stage tip）清理多余的标签。使用Savant SpeedVac（Thermo Fisher Scientific）干燥样品。将样品重悬于0.1%甲酸中，然后上样到与UltiMate 3000高性能纳米液相色谱系统（Thermo Fisher Scientific）偶联的QExactive Orbitrap质谱仪上。肽段在240分钟的梯度内洗脱，从H₂O:CH₃CN (98:2, 0.1% 甲酸) 渐变至 H₂O:CH₃CN (64:36, 0.1% 甲酸)，并以200 nL/min的流速直接引入电喷雾离子源。质谱（MS）谱图在350–1,750 m/z的质量范围内获得，分辨率为70,000 (m/z)，MS/MS分辨率为45,000 (m/z)。选择15个最丰富的离子进行更高能量碰撞解离（HCD）碎裂。每个生物学重复进行两次技术重复。

肽段鉴定和定量

将TMT10和TMT6实验合并并归一化到混合参考样本。将MS谱图导入Proteome Discoverer（Thermo Fisher Scientific）软件（版本2.3），并使用SEQUEST HT针对包含Tohama I、CS、B1917（ptxP3）和B1920（ptxP1）完整基因组的自定义百日咳鲍特菌数据库进行搜索。肽段耐受度设置为4 ppm，MS/MS耐受度设置为0.04 Da。可变修饰设置为羧甲基化（C）和氧化（M），固定修饰设置为TMT-6plex（K）、TMT-6plex（N端）、TMT-10plex（K）和TMT-10plex（N端）。酶特异性设置为胰蛋白酶，最大漏切位点为1，每个蛋白质的最小肽段数设置为2。根据Bart等人（2）分配功能类别。使用pSORTb（版本3.0.2）预测每个蛋白质的亚细胞位置。

MRM-hr

使用高分辨率多反应监测（MRM-hr）质谱法来确认上述TMT-MS实验中鉴定的丰度变化。MRM-hr实验在两个代表性菌株（L1423和L1191）上进行，然后进一步对来自每个簇的另外六株菌进行。如TMT实验所述培养生物膜。选择对照蛋白质作为内标以标准化强度。这些蛋白质是根据TMT实验中FC = 1 ± 0.1来选择的。分析在QExactive Orbitrap质谱仪上进行。使用Skyline（版本21.1.0.278）设计分析。筛选蛋白质肽段是否适合MRM-hr。排除了可能存在末端不齐、漏切或易受可变修饰影响的氨基酸的肽段。除非鉴定到至少两个合适的肽段，否则排除该蛋白质。根据Skyline自动峰检测方法（35）选择每个肽段的最高峰高和面积。对代表性菌株进行了六个生物学重复，而每个额外的簇菌株被视为该簇的一个生物学重复。每个生物学重复进行两次技术重复并注入质谱仪进行分析。

将十微克蛋白质如上所述进行胰蛋白酶消化。使用C18 StageTips（Thermo Fisher Scientific）清理样品，并在30分钟梯度内注入质谱仪。MRM-hr采集包括一个50 ms的MS扫描，然后是每个周期35个候选离子的MS/MS扫描（110 ms累积时间，35,000 m/z分辨率）。使用Skyline确定每个肽段的碰撞能量，可在表S1中找到。保留时间根据先导非计划MRM-hr运行进行调度（36）。

L1423和L1191的基因组比较

百日咳鲍特菌菌株L1423（SNP簇I）和L1191（SNP簇II）的完整基因组先前已被测序（10）。使用Mauve（版本20150226）（37）比较基因组序列。使用Clustal Omega（38）比较蛋白质序列。

统计分析

对于共聚焦显微镜，使用GraphPad PRISM（版本9.1.0）中的双因素方差分析（two-way ANOVA）和Sidak多重比较检验计算菌株间生物量、平均厚度、粗糙系数和最大厚度的统计学差异。

对于TMT，折叠变化（FC）> 1.2的蛋白质被视为上调，FC < 0.8的蛋白质被视为下调。这些截断值被其他蛋白质组学研究广泛使用（34）。在Proteome Discoverer中执行双尾Student t检验并进行Benjamini-Hochberg（BH）校正以评估统计学显著性。最后，对于MRM-hr，结果在Skyline中使用内置R包MS-stats（版本4.1.2）（36）进行分析，使用经过BH校正的t检验。对于TMT和MRM-hr，BH校正后的P值（q值）< 0.05被认为具有统计学显著性（34）。

RESULTS

SNP簇I和SNP簇II菌株生物膜形成能力的比较

进行了共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）以鉴定簇I菌株L1423和簇II菌株L1191之间生物膜形成的变化。我们证实百日咳鲍特菌在96小时形成成熟的生物膜，如先前报道（15, 20, 27）。虽然两种菌株随时间的生物膜形成相似，但在96小时时观察到L1423和L1191菌株之间存在明显的视觉差异（图1）。与L1191相比，L1423菌株显示出更致密的结构。使用ImageJ上的COMSTAT2插件，测量了每个菌株的生物量、平均厚度、粗糙系数和最大厚度。尽管在96小时时结构存在视觉差异，但在任何时间点，两种菌株之间的生物膜平均厚度、最大厚度、生物量或粗糙系数均无显著差异（图2）。

簇I菌株L1423和簇II菌株L1191生物膜蛋白质的比较

为了确定可能导致CLSM分析中看到的差异的潜在蛋白质，对L1423和L1191生物膜提取的蛋白质进行了TMT-MS分析。共鉴定到1,453种蛋白质，约占已知百日咳鲍特菌蛋白质总数的45%（表S2）。鉴定出的蛋白质中预测位于细胞质的比例很高（57%），而14%的蛋白质位于细胞质膜。其他蛋白质分布在外周质空间（4%）、外膜（3%）和细胞外空间（1%）。其余蛋白质的位置无法预测（19%）。共有40种蛋白质在两种菌株之间存在显著（0.8 > FC > 1.2，调整后P < 0.05）丰度差异（图3A）。与L1191相比，L1423中有18种蛋白质显著下调，22种显著上调（表2和表3）。

最显著的变化是簇I菌株中能量代谢功能类别的蛋白质上调（图3B）。L1423中有七种能量代谢蛋白上调。这些包括四种细胞色素蛋白（PetABC和BP3650）以及NADH-醌氧化还原酶亚基（NuoBH）和ATP合酶（AtpD）。只有两种与致病性相关的蛋白质被差异调节：Fim2在L1423中上调，而Fim3在L1191生物膜细胞中上调。有趣的是，两种铁载体生物合成蛋白AlcBC在L1423生物膜细胞中下调。先前显示在浮游条件下两种菌株之间存在显著变化的蛋白质（13），ModA和BP3303，也分别被发现在L1423中上调和下调。两种LysR转录调节蛋白（BP0437和BP2520）下调，以及两种DNA结合蛋白（HupB和Dps）也下调。最后，有五种细胞表面蛋白在L1423生物膜细胞中上调（图3B）。

使用MRM-hr确认蛋白质丰度差异

使用高分辨率多反应监测（MRM-hr）质谱法来确认上述TMT-MS实验中鉴定的丰度变化。在40种菌株间存在显著丰度差异的蛋白质中，选择了9种具有合适肽段的蛋白质用于MRM-hr确认（表4；表S1）。Fim2和Fim3被排除在分析之外，因为它们与菌株血清型相关，这已是已知的（10）。测试的上调蛋白是PetC、BP3650、BP2924、AtpD和RplW。测试的下调蛋白是AlcC、NusB、BP1364和BP2652。选择三种非差异丰度蛋白DnaK、ClpB和RpsA作为归一化的对照蛋白（表4）。

MRM-hr实验证实PetC和BP3650在L1423中上调，而AlcC被证实在L1423中下调（调整后P值 < 0.05）（表S3）。还发现AtpD在L1423中下调，这与TMT结果相反（图4）。

此外，为了确认鉴定出的差异是菌株特异性差异还是簇特异性差异，对来自每个簇的另外六株菌进行了MRM-hr，并测量了上述相同九种蛋白质的丰度。发现这些蛋白质的丰度在簇之间没有显著差异（表S4）。有趣的是，发现菌株间存在高度变异性（图5）。变异最高的蛋白质是ATP合酶（AtpD）和输出蛋白（BP2652）（CV = 27.08% 和 27.04%），其中L700（SNP簇II菌株）和L1042（SNP簇II菌株）分别具有这些蛋白质的最高丰度。值得注意的是，SNP簇I菌株L1398的AtpD、BP2652和铁载体生物合成蛋白（AlcC）的丰度最低。然而，L1398的核糖体蛋白（RplW）值最高，并且细胞色素蛋白BP3650和PetC的值相对较高（图5）。

某些蛋白质的丰度之间存在相关性，表明这些蛋白质可能受到共同调节。BP2652的丰度与NusB（Pearson相关性：r [10] = 0.677, P = 0.016）和AtpD（r [10] = 0.606, P = 0.037）呈正相关，而与RplW（r [10] = -0.559, P = 0.039）呈负相关（图6）。NusB的丰度也与BP2924呈正相关（r [10] = 0.726, P = 0.008）。最后，BP1364与RplW（r [10] = -0.638, P = 0.026）和PetC（r [10] = -0.704, P = 0.011）呈负相关（图6）。

DISCUSSION

尽管疫苗接种覆盖率很高，但全球范围内百日咳鲍特菌的报告病例数有所回升（3, 40-43）。据推测，导致回升的一个因素与百日咳鲍特菌形成生物膜的能力有关（18, 44）。我们先前研究了一个SNP簇I菌株（L1423）的浮游细胞和生物膜细胞之间的蛋白质组差异，鉴定出>400种在生物膜中差异丰度的蛋白质，包括毒素上调、III型分泌系统下调以及细胞从浮游状态利用乙醛酸分流转向生物膜中利用完整TCA循环（27）。生物膜形成能力的增强先前也被假设能增加临床分离株在呼吸道的定植（20）。与回升相关的还有SNP簇I菌株（ptxP3等位基因型）的扩展，取代了先前占主导地位的SNP簇II菌株（ptxP1等位基因型）（3, 24, 45, 46）。先前的研究检查了这些簇的菌株在浮游条件下的差异，但未涉及生物膜（12, 13, 47）。在本研究中，我们比较了簇I和簇II菌株的生物膜形成和蛋白质丰度，以确定可能有助于解释簇I优势地位的变化。我们发现两个SNP簇具有相似的生物膜形成能力，但它们的生物膜结构不同。

首先，研究了来自每个簇的一个代表性菌株（L1423和L1191）。选择这两种菌株是因为它们是每个簇中研究最深入的，并且都经过测序并用于小鼠模型的比较感染研究和浮游条件下的蛋白质组学研究（10, 13）。此外，选择L1423是因为它属于SP13和EL4。SP13和EL4分别是簇I中的主要SNP谱和谱系，是2008-2017年澳大利亚疫情暴发的原因（9, 48）。EL4是一个庞大的全球谱系，最近发布的基因分型研究表明，EL4在澳大利亚从2010年扩展到2019年，并且是2019年检测到的主要流行谱系（49）。因此，尽管L1423是十年前分离的，但它仍然具有流行病学相关性，并且代表了当前在澳大利亚和其他使用ACV的发达国家流行的最常见谱系。对于L1191，选择该菌株是因为它是在相同的2008-2010年流行期间分离到的最新的簇II菌株。所有其他簇II菌株均在2008年之前分离，此后在澳大利亚未检测到（49）。

L1423和L1191都具有一致的生物膜生长，并且在96小时时具有可比的生物量水平（图2）。然而，观察到簇II菌株具有更弥散的结构，而簇I菌株具有更致密的生物膜结构（图1）。先前报道过来自两个不同地区（阿根廷和美国）的百日咳鲍特菌菌株之间成熟生物膜结构的差异（20）。发现来自阿根廷的分离株形成的生物膜是均匀的细胞层，类似于本研究中两种菌株所识别的情况，而来自美国的菌株形成不规则形状的聚集体（20）。应该指出的是，在阿根廷和美国百日咳鲍特菌菌株之间识别的结构差异（20）比本研究中识别的差异更容易辨认。一种可能性可能是本研究中使用了SYTO 9，它结合所有DNA，包括生物膜基质中的细胞外DNA。这可能会掩盖由于生物膜细胞外DNA变化而导致的生物量和生物膜结构差异。未来使用GFP标记菌株的研究可以进一步阐明生物膜结构和百日咳鲍特菌分泌的任何细胞外DNA。此外，虽然Cattelan等人（20）的研究在结合生物膜的基底层面识别了差异（即覆盖整个表面的生物膜与聚集的聚集体），但本研究中识别的变化涉及生物膜内细胞的密度。本研究的结果表明，如果簇I菌株的优势地位与生物膜有关，那么存在更微妙的变化，而不是整体的生物膜形成能力，这些变化可能有助于先前观察到的适应性增强（10）。

本研究探讨了簇I和簇II菌株在生物膜条件下蛋白质丰度的差异，以确定可能与结构差异相关的变化。两个代表性菌株之间最显著的变化是PetABC和BP3650细胞色素蛋白的上调。PetABC是细胞色素bc复合物（复合物III），它将电子转移到细胞色素c（BP3650）并跨膜转运质子以产生驱动ATP合酶的质子动力（50）。发现在其他物种中，PetABC在铁抑制条件和低氧条件下上调（51-53）。这表明在簇I菌株中可能触发了低铁或低氧环境中诱导的调节途径。低铁和低氧环境可能与簇I菌株中由于生物膜结构更致密而导致的营养物质扩散较低有关。

对额外菌株的分析发现，PetABC和BP3650的变化是L1191菌株特异性的（图5）。这可以通过在簇II（L1191）菌株中特异性观察到的基因组变化来解释。比对L1423和L1191的序列，发现在L1191的petB基因（核苷酸位置619920）中有一个插入序列（IS481）（图S1）。这个插入可能会破坏蛋白质，使其无法正确产生。比对蛋白质序列以观察可能发生在蛋白质功能中的变化。发现插入序列导致C末端截短（氨基酸位置418），其中包括一个预测的PetB蛋白跨膜结构域，这可能会影响其作为电子传递链复合物的功能（图S2）。这种破坏也可能导致观察到的BP3650丰度变化，因为它们都是