通过囊泡蛋白质组学揭示AP-1与AP-4的货物客户及辅助因子

本研究利用大规模体外囊泡形成实验结合无标记定量质谱分析，系统鉴定了TGN（trans-Golgi network）定位的衔接蛋白复合物AP-1和AP-4的货物分子及其调控因子，发现CAB45为AP-1依赖性货物，ATRAP为AP-4依赖性货物，并揭示WDR44和PRRC1作为AP-4介导的TGN输出的关键细胞质调控因子，为分泌通路中货物分选机制提供了新见解。

　　

Significance

衔接蛋白复合物AP-1和AP-4在反式高尔基体网络（TGN）介导蛋白质分选，然而其货物客户及调控因子尚未完全明确。本研究通过大规模囊泡形成实验结合无标记定量质谱技术，揭示了两者不同的货物谱系，鉴定出CAB45作为AP-1依赖性货物，ATRAP作为AP-4依赖性货物，同时发现PRRC1和WDR44作为AP-4介导的TGN输出的细胞质调控因子。这些结果拓展了对衔接蛋白功能与特异性的认知，为系统发现分泌通路中新的货物客户及调控因子提供了可靠框架。

Abstract

TGN是分泌通路中的关键分选站，衔接蛋白复合物（AP）在此确保货物选择性包装至运输囊泡。然而，与单个AP复合物相关的货物及调控因子全集仍不清楚。值得注意的是，AP-4介导的TGN输出不依赖网格蛋白（clathrin），表明囊泡生物发生中涉及未表征的辅助因子。为解决这一问题，本研究利用野生型HeLa细胞或AP1γ1/AP4ε缺陷细胞，建立体外囊泡形成实验，并结合无标记定量质谱技术，绘制了AP-1（从TGN和ARF1阳性内体出芽）与AP-4的 distinct 货物谱，鉴定出45 kDa钙结合蛋白（CAB45）为AP-1依赖性货物，Ⅰ型血管紧张素Ⅱ受体相关蛋白（ATRAP）为AP-4依赖性货物。此外，研究发现PRRC1和WDR44是AP-4介导的TGN输出所必需的细胞质调控因子。该研究增进了对AP-1和AP-4在分泌运输中机制的认知，并为系统鉴定特定衔接蛋白复合物的货物客户及辅助因子提供了可靠策略。

引言

反式高尔基体网络（TGN）是分泌通路中的关键运输枢纽，确保货物蛋白准确递送至目的地。为维持蛋白质运输的保真度，TNG employ 复杂的蛋白质分选机制，将货物包装至特定运输囊泡以递送至下游区室。TGN分选缺陷会破坏蛋白质靶向，导致一系列生理功能受损，包括细胞极性丧失、免疫功能受损和分泌失调。衔接蛋白复合物（APs）是蛋白质分选的关键参与者，在分泌和内吞途径中介导货物选择与囊泡形成。在高等真核生物中，已鉴定出五种AP复合物，每种由两个大亚基、一个中亚基和一个小亚基组成。值得注意的是，作用于TGN和ARF1阳性内体的AP-1与AP-4对TGN的货物输出尤为重要。这些复合物亚基的突变与严重人类疾病相关。例如，编码AP-1σ1亚基的AP1S1基因突变与MEDNIK综合征相关，而AP1S2突变导致X连锁智力障碍。同样，AP-4任何亚基的突变均会导致“AP-4缺陷综合征”，一种复杂的遗传性痉挛性截瘫（HSP）。此外，AP-4的ε亚基突变与家族性持续性口吃1（STUT1）相关。

理解AP-1和AP-4的货物客户对于阐明其在正常生理与疾病中的功能角色至关重要。迄今，AP-1已被证明介导多种货物的TGN输出，包括对建立细胞极性至关重要的平面细胞极性蛋白Vangl2，以及钾通道Kir2.1。AP-1还在递送基底外侧货物蛋白以维持顶基极性及神经元细胞中TGN的树突蛋白分选中起关键作用。另一方面，AP-4调控自噬相关蛋白9A（ATG9A）从TGN的输出，促进自噬体形成，并介导对中枢神经系统发育和功能至关重要的载脂蛋白E受体2（ApoER2）的运输。AP-4还显示介导TGN输出淀粉样前体蛋白（APP），从而减少γ-分泌酶介导的淀粉样β肽切割。尽管取得这些进展，参与AP-1和AP-4介导运输的货物及辅助因子全集仍知之甚少。值得注意的是，AP-4介导的TGN输出似乎不依赖网格蛋白，表明囊泡形成中涉及未鉴定的辅助因子。

为全面理解衔接蛋白的功能角色，需要可靠的方法来系统鉴定其货物客户及对衔接蛋白复合物介导的TGN输出至关重要的细胞质因子。以往研究采用多种策略应对这一挑战。例如，PAIRS（Pairing Analysis of Cargo Receptors）成像方法在酵母中鉴定出依赖特定受体进行ER输出的货物蛋白，但仅限于分析约150种荧光标记的货物分子。另一种方法，动态细胞器作图结合蛋白质组学，揭示了AP-4的货物客户如ATG9A、SERINC1、SERINC3和DAGLB。然而，该方法评估的是细胞器内的蛋白质丰度而非直接作用于囊泡。

为克服这些局限，本研究近期开发了大规模囊泡形成实验结合无标记定量质谱技术，允许直接分析囊泡相关蛋白质。本研究使用AP1γ1或AP4ε敲除（KO）细胞的细胞质进行囊泡形成实验，分离囊泡组分并通过定量质谱分析其内容物。该策略使我们能够鉴定AP-1和AP-4依赖性货物蛋白用于TGN输出，以及AP-4介导运输所需的关键细胞质因子。研究发现为理解AP-1和AP-4的作用提供了见解，并揭示了AP-4依赖性TGN输出的关键细胞质组分。

Results

An In Vitro Vesicle Formation Assay Combined With Proteomic Analysis to Identify the Cargo Clients of AP-1.

为揭示依赖AP-1或AP-4包装入运输囊泡的货物蛋白，研究利用已建立的体外囊泡形成实验。简言之，细胞在20°C孵育以在TGN积累新合成货物蛋白。透化处理后，半完整细胞（SI cells）在32°C与细胞质、GTP和ATP再生系统（ATPrS）孵育。孵育后，新形成囊泡通过离心与供体膜分离。由此产生的上清液含囊泡，调整至35% Opti-Prep，覆盖30% Opti-Prep和反应缓冲液，离心分离囊泡与未关联细胞质蛋白。

作为初步步骤，研究利用该实验重构Vangl2（已知AP-1货物客户）包装入运输囊泡。Vangl2对调节平面细胞极性至关重要，其从TGN输出依赖于被AP-1识别的酪氨酸分选 motif。研究发现，野生型（WT）HeLa细胞制备的细胞质而非AP1γ1 KO HeLa细胞细胞质促进HA-Vangl2包装入运输囊泡。此外，AP1γ1 KO细胞质观察到的出芽效率降低可通过使用源自过表达AP1γ1-FLAG的AP1γ1 KO HeLa细胞的细胞质来挽救。相比之下，COPII囊泡标准货物蛋白SEC22B在使用AP1γ1 KO HeLa细胞质时显示出比WT HeLa细胞质更高的出芽效率，与外源AP1γ1-FLAG的表达无关。研究发现，内部COPII外壳亚基SEC23A的丰度在WT和AP1γ1 KO HeLa细胞制备的细胞质间保持可比，而外部COPII外壳亚基SEC31A的丰度在KO细胞质中显著升高。值得注意的是，重新引入AP1γ1-FLAG并未将SEC31A恢复至WT水平。该观察与使用AP1γ1 KO HeLa细胞质时囊泡组分中SEC22B丰度增加一致，即使存在外源AP1γ1-FLAG。

Vangl2包装的成功重构验证了囊泡形成实验的功能性，并暗示其鉴定AP-1依赖性货物蛋白的潜力。在此基础上，研究进行大规模囊泡形成实验结合无标记定量质谱以系统鉴定AP-1货物客户。使用源自AP1γ1 KO HeLa细胞的半完整细胞及从WT或AP1γ1 KO HeLa细胞提取的细胞质，在囊泡组分中鉴定出1,205种蛋白质。对每种蛋白质，计算WT组与AP1γ1 KO组相比的丰度变化倍数。该分析揭示66种蛋白质变化倍数大于1.3且p值小于0.05。重要的是，AP-1复合物的两个亚基 among 鉴定蛋白质，验证了方法的可靠性。

在鉴定的66种蛋白质中，6种被UniProt预测为跨膜货物蛋白，3种为可溶性分泌货物蛋白。在预测跨膜蛋白中，3种预测显示高尔基体定位，3种预测显示质膜定位，1种预测显示内体和溶酶体定位。

CAB45 Is a Cargo Client of AP-1.

研究 then 聚焦于一种鉴定出的位于TGN腔的货物客户CAB45，并调查AP-1是否介导其从TGN输出。与蛋白质组数据一致，囊泡组分的免疫印迹分析显示，当使用AP1γ1 KO细胞细胞质时，CAB45包装入囊泡显著减少 compared to WT细胞细胞质。相比之下，VTI1B的包装不受AP1γ1耗竭影响。

为进一步确认CAB45的TGN输出由AP-1介导，研究采用温度转移实验。在该实验中，表达CAB45-HA的细胞首先在20°C孵育2小时以阻断货物蛋白从TGN输出，随后转移至32°C以释放货物。20°C孵育后，CAB45-HA主要在WT、AP1γ1 KO和AP4ε KO HeLa细胞的TGN积累，少于20%细胞显示点状结构。温度转移至32°C 45分钟后，CAB45-HA在WT和AP4ε KO HeLa细胞中从高尔基体高效释放。然而，在AP1γ1 KO HeLa细胞中，CAB45-HA在大多数细胞中主要仍积累于高尔基体。温度转移后具点状CAB45定位的细胞百分比在AP1γ1 KO细胞中显著低于WT细胞，表明缺乏AP1γ1时CAB45从TGN输出存在缺陷。类似地，用靶向AP1γ1的siRNA转染的WT HeLa细胞也显示CAB45-HA从TGN输出的缺陷。这些发现证明AP-1在调节CAB45的TGN输出中起关键作用，确立其作为AP-1依赖性货物蛋白。

温度转移后，大量CAB45仍定位于WT细胞的高尔基体区域。该发现与既往研究一致，该研究报道在20°C孵育2小时后37°C孵育2小时，仅17% CAB45释放入培养基。一种可能解释是，与典型分泌货物不同，CAB45尽管能够分泌，仍维持在高尔基体内的稳态定位。因此，其输出效率可能 inherently 不同于典型可溶性分泌蛋白。

An In Vitro Vesicle Formation Assay Combined With Proteomic Analysis to Identify the Cargo Clients of AP-4.

上述分析证明，囊泡形成实验结合无标记定量质谱是鉴定AP-1货物蛋白的可靠有效方法。基于此方法，研究 next 试图鉴定依赖另一TGN定位衔接蛋白AP-4以富集入TGN衍生囊泡的货物蛋白。ATG9A，一种已知AP-4货物，据报道通过其细胞质尾部酪氨酸 motif 直接与AP-4相互作用。为测试囊泡形成实验是否可用于鉴定AP-4货物，研究 employ 该实验重构ATG9A包装入运输囊泡。标准COPII货物蛋白ERGIC53和SEC22B用作对照。ATG9A、ERGIC53和SEC22B包装入囊泡显示依赖细胞质。与既往报告一致，包含非水解形式GTP（GMPPNP）或SAR1A的GTP酶缺陷突变体（SAR1A^H79G）抑制ERGIC53和SEC22B包装入囊泡。相比之下，ATG9A包装入运输囊泡不受GMPPNP或SAR1A^H79G显著影响。这些结果表明ATG9A释放入运输囊泡不依赖GTP水解，将其包装机制与正常COPII货物蛋白区分开来。

研究进行TGN囊泡形成实验，使用源自AP4ε KO HeLa的半完整细胞，以及来自WT或AP4ε KO HeLa细胞的细胞质。WT HeLa细胞细胞质而非AP4ε KO HeLa增强ATG9A包装入运输囊泡。该发现确认囊泡形成实验有效重现AP-4参与ATG9A包装入运输囊泡。为鉴定AP-4货物客户，研究进行囊泡形成实验配对无标记定量质谱分析，使用源自AP4ε KO HeLa的半完整细胞及从WT或AP4ε KO HeLa提取的细胞质。在囊泡组分中的分析鉴定出总共1,451种蛋白质，其中139种显示显著变化，倍数增加超过1.3且p值小于0.05。值得注意的是，该组包括两种已知AP-4货物，ATG9A和DAGLB，确认方法在揭示AP-4货物客户中的功效。在这139种蛋白质中，18种预测为跨膜蛋白，4种为可溶性分泌货物蛋白。在鉴定跨膜货物蛋白中，15种预测显示质膜定位，4种预测显示高尔基体定位，4种预测显示内体或溶酶体定位。

ATRAP Is an AP-4 Cargo.

在鉴定出的AP-4货物客户中，研究聚焦于Ⅰ型血管紧张素Ⅱ受体相关蛋白（ATRAP/AGTRAP），其预测定位于高尔基体和质膜。ATRAP水平在WT和AP4ε KO HeLa组间显示变化倍数>1.3但在wt和ap1γ1 ko组间<1，表明其TGN输出依赖AP-4而非AP-1。类似趋势在两种已知AP-4客户ATG9A和DAGLB中观察到。

为进一步探索AP-4是否介导ATRAP的TGN输出，研究进行囊泡形成实验并通过免疫印迹分析囊泡组分。结果与蛋白质组数据一致，显示当使用AP4ε KO细胞细胞质进行囊泡形成实验时，囊泡组分中ATRAP和ATG9A的丰度显著减少 compared to WT细胞质。与既往报告一致，HeLa细胞中AP4ε KO导致细胞质ATG9A减少和TGN积累。定量分析表明，高尔基区域ATG9A高于阈值荧光强度与总细胞区域之比在AP4ε KO细胞中显著高于WT细胞。ATRAP在WT HeLa细胞中出现在近核区域和细胞外围的点状结构。相比之下，ATRAP在AP4ε KO细胞中主要积累在近核高尔基区域。研究 then 进行敲低分析，发现AP4μ敲低也导致ATG9A和ATRAP在高尔基区域积累显著增强。这些发现 collectively 表明AP-4在促进ATRAP从TGN高效输出中起关键作用。

AP-4 Interacts With the Tyrosine Motif of ATRAP, and This Interaction Is Important for TGN Export of ATRAP.

共免疫沉淀实验证明AP4ε-GST结合ATRAP-HA，表明ATRAP与AP-4相互作用。值得注意的是，AP-4先前显示识别特定蛋白质细胞质尾部中的YXXΦ[E/D] motif，如ATG9A，而ATRAP包含类似且保守的酪氨酸 motif。为调查该 motif 的重要性，研究采用GST pull-down实验，显示纯化的GST标记AP4μ C末端片段（AP4μ^160–453）结合ATRAP-HA。当使用ATRAP-HA突变体形式，其中关键酪氨酸被丙氨酸替代（ATRAP^Y133A-HA）时，该相互作用显著减少。进一步免疫荧光分析显示，虽然野生型ATRAP-HA部分定位于TGN并出现在细胞外围点状结构，ATRAP^Y133A-HA突变体在低表达时主要积累于TGN。定量分析显示，酪氨酸突变体 compared to 野生型蛋白，高尔基区域ATRAP高于阈值荧光强度与总细胞区域之比显著更高。这些结果凸显酪氨酸 motif 在促进AP-4与ATRAP间相互作用中的关键作用，这对ATRAP从TGN高效输出至关重要。

Identification of Cytosolic Proteins Mediating the Trafficking of AP-4 Cargos.

AP-4介导的TGN输出被认为不依赖网格蛋白，指向协助AP-4在TGN囊泡形成的未鉴定辅助因子的参与。WT组与AP4ε KO组相比富集蛋白质的分析揭示几种细胞质蛋白，被Uniprot预测定位于高尔基体或内体。这些细胞质因子可能作为AP-4辅助因子。当使用AP4ε KO细胞质进行囊泡形成实验时，辅助因子 proposed 未能被招募至囊泡膜，导致丰度减少。研究聚焦后续分析于两个命中：PRRC1和WD重复包含蛋白44（WDR44）。

WDR44是一种WD重复包含蛋白。WD重复包含蛋白参与多种细胞过程，包括蛋白质复合物组装。为探索WDR44在TGN分选中的作用，研究在WT HeLa细胞中进行siRNA敲低。WDR44敲低导致 compared to 对照siRNA，ATG9A在高尔基体积累增加。定量显示WDR44敲低细胞中高尔基区域ATG9A高于阈值荧光强度与总细胞区域之比显著上升。研究 then 生成HA标记、siRNA抗性WDR44构建体（WDR44-HA），其定位于细胞质，与HeLa细胞中既往发现一致。值得注意的是，表达该构建体挽救ATG9A运输缺陷。

研究还进行温度转移实验以评估WDR44在TGN输出中的作用。在用对照siRNA转染的细胞中，高尔基体定位ATG9A在20°C 2小时后显著增加并在转移至32°C后部分释放。值得注意的是，虽然WDR44敲低在正常条件下增加高尔基体定位ATG9A，20°C阻断未能引起这些细胞中额外积累。此外，积累的ATG9A在WDR44敲低细胞中在温度转移至32°C后显示受损释放。此外，在囊泡形成实验中，细胞质中存在WDR44-HA导致囊泡组分中ATG9A丰度显著增加，而ERGIC53和SEC22B丰度保持不变。这些观察 collectively 表明WDR44在ATG9A的TGN输出中起关键作用。

PRRC1，一种脯氨酸丰富和卷曲螺旋包含蛋白，显示与内部COPII外壳相互作用，调节COPII的膜关联。研究发现内源性PRRC1在细胞外围显示点状定位，与COPII标记SEC31A的点状结构亚群共定位，以及近核高尔基区域。为测试PRRC1是否调节AP-4介导的TGN输出，研究生成PRRC1 KO HeLa细胞系并评估两种AP-4货物ATG9A和ATRAP在WT和PRRC1 KO HeLa细胞中的定位。在PRRC1 KO细胞中，ATRAP主要定位于TGN，无WT细胞中观察到的典型外围点状结构，表明其TGN输出 disruption。定量分析表明，高尔基区域ATRAP高于阈值荧光强度与总细胞区域之比在PRRC1 KO细胞中显著增加 compared to WT细胞。相比之下，AP-1货物EGFR的定位在WT和PRRC1 KO细胞的细胞表面保持未受影响，表明PRRC1对TGN输出的影响是货物特异性的。此外，共免疫沉淀实验表明AP-4与PRRC1相互作用。

有趣的是，在相同实验条件下，ATG9A显示 distinct 定位模式。在WT HeLa细胞中，ATG9A exhibited 近核结构和细胞质点状。然而，在PRRC1 KO HeLa细胞中，ATG9A主要定位于ER，如其与ER标记Climp-63的共定位所示。定量分析表明，高尔基区域ATG9A高于阈值荧光强度与总细胞区域之比在PRRC1 KO细胞中显著减少 compared to WT细胞。该缺陷通过过表达PRRC1-HA挽救。这些分析表明PRRC1在ATG9A的ER输出中起重要作用，作用于其从TGN输出的上游。此外，纯化PRRC1显著增强ATG9A包装入囊泡的效率。当使用较低浓度大鼠肝细胞质进行实验时，COPII货物ERGIC53和SEC22B的包装效率也被纯化PRRC1增强。

鉴于ATG9A参与自噬，研究评估了LC3（自噬体标记）在WT和PRRC1 KO细胞中正常和饥饿诱导条件下的定位。虽然点状LC3结构在饥饿WT细胞中形成，表明自噬激活，LC3在PRRC1 KO细胞正常条件下 appear 更分散并在饥饿期间未能形成WT细胞中观察到的特征性点状。这些发现 underscore PRRC1在AP-4货物运输中的重要性， specifically ATG9A和ATRAP。 Moreover，它们 highlight PRRC1在调节不同货物蛋白中的多功能角色，影响 not only 高尔基体至细胞表面运输 but also 自噬。

Discussion

APs在TGN介导蛋白质分选中起关键作用。本研究采用囊泡形成实验，使用WT细胞或缺乏AP-1或AP-4亚基细胞制备的细胞质。该方法使我们能够鉴定AP-1和AP-4的潜在货物客户。生化验证揭示CAB45作为AP-1货物。CAB45主要定位于TGN腔，在那里以Ca²⁺依赖方式结合可溶性货物分子子集并促进其从TGN分选。然而，作为可溶性蛋白，CAB45在TGN包装入囊泡的机制仍不清楚。体外囊泡形成实验结合完整细胞中的遗传扰动揭示AP-1对CAB45从TGN输出至关重要。这些发现表明AP-1作为负责指导CAB45包装入运输载体的细胞质因子。研究 propose 未鉴定跨膜受体可能连接CAB45至AP-1 machinery，使其选择性富集入囊泡。基于研究发现，CAB45客户货物也应需要AP-1用于从TGN输出。然而，质谱分析未检测到已确立CAB45货物如LysC和COMP，可能 due to 囊泡组分中其低丰度或 trypsinization 期间丢失。

此外，研究鉴定ATRAP作为AP-4货物，其相互作用依赖于其细胞质结构域中酪氨酸分选 motif。ATRAP最初表征为血管紧张素ⅡⅠ型受体（AT1R）结合蛋白，促进AT1R内化并抑制血管平滑肌细胞中AT1R介导的细胞增殖。超越其在AT1R信号中的作用，ATRAP与转铁蛋白受体1（TfR1）相互作用以调节其内化，从而影响铁代谢和氧化应激反应。值得注意的是，ATRAP缺陷加剧老年小鼠肾纤维化，独立于血管紧张素信号，highlighting 其在细胞稳态和疾病中的更广泛 implications。研究结果表明ATRAP包装入TGN衍生囊泡是AP-4依赖性，implicating 其在AP-4缺陷综合征中的潜在角色。

除鉴定货物蛋白外，方法还揭示参与TGN蛋白质分选的辅助因子。传统去垢剂 based 结合实验通常未能捕获依赖脂双层的蛋白质相互作用。相比之下，囊泡形成实验保留ER和高尔基体的脂双层环境，使能够鉴定膜关联结合伙伴。通过该方法，研究鉴定WDR44和PRRC1作为参与AP-4介导TGN货物分选的细胞质因子。

WDR44，Rab11的下游效应器，结合GTP结合Rab11并参与Rab11依赖性囊泡回收。Rab11及其效应器，包括WDR44，在纤毛发生中起作用。WDR44以Rab11、Rab8和Rab10依赖性方式形成管状结构，并参与对ER应激敏感蛋白质的输出。WDR44还与COPII外部外壳蛋白Sec13相互作用，implicating 其在囊泡运输中的作用。研究发现表明WDR44促进ATG9A的TGN输出，highlighting 其在TGN衍生囊泡内的功能多样性。PRRC1，研究中鉴定的另一细胞质蛋白，显示在ER出口位点和高尔基体的双重定位。研究先前显示PRRC1调节COPII膜关联和ER至高尔基体运输。这里，研究证明PRRC1与AP-4相互作用并差异调节AP-4客户ATG9A和ATRAP的运输，表明其在囊泡运输中的复杂角色。这些发现 underscore 囊泡形成实验结合蛋白质组分析在鉴定调节囊泡运输的辅助蛋白中的效用。

WDR44包含WD40重复，形成对蛋白质-蛋白质相互作用至关重要的β-螺旋桨结构。该结构特征对COPII和网格蛋白包被囊泡中外壳蛋白的组装至关重要，表明WDR44可能在AP-4外壳组装中起作用。另一方面，PRRC1包含脯氨酸丰富结构域，已知促进蛋白质-蛋白质相互作用，提供结构灵活性，并招募囊泡形成 machinery 组分。虽然PRRC1在AP-4外壳组装中的角色仍不清楚，其脯氨酸丰富结构域表明调节囊泡运输的潜在参与。需要进一步研究以阐明WDR44和PRRC1贡献于AP-4介导囊泡形成的精确机制。