扩展时间分辨电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）的技术能力，以表征高盐介质中的细胞和生物生成纳米颗粒

《Analytica Chimica Acta》：Expanding time-resolved ICP-MS capabilities for characterizing cells and biogenic nanoparticles in hypersaline media

时间分辨电感耦合等离子体质谱法（TRA ICP-MS）被优化用于分析高溶解固体浓度（200 g L?1）下嗜盐古菌Haloferax mediterranei的单细胞铅生物积累和硒纳米颗粒（SeNPs）生成。通过采用高效率雾化器与双通道喷雾室组合，并在线稀释至1:103以减少盐效应，成功保持细胞完整性。结果显示，单细胞铅摄取量异质性显著（20-300 ag cell?1），且与SeNPs（47-73 nm）存在共定位现象，表明SeNPs主要内源性存在而非自由悬浮。该技术为极端环境下微生物纳米材料研究提供了新方法。

　　在高盐度环境中对嗜盐微生物进行分析一直是一个具有挑战性的课题，尤其是在使用时间分辨电感耦合等离子体质谱（TRA ICP-MS）技术时。由于这些微生物培养基中总溶解固体（TDS）浓度高达200 g/L，这会导致严重的基质效应，从而干扰检测信号的稳定性与准确性。为了解决这一问题，本研究引入了一种创新的方法，以**Haloferax mediterranei**作为模型微生物，成功克服了高盐度环境下的分析难题。该方法不仅保留了细胞的完整性，还显著降低了基质效应，使得能够通过TRA ICP-TOFMS技术对Pb的生物富集以及硒纳米颗粒（SeNPs）的形成进行研究。这为深入理解嗜盐微生物在极端环境中的生理反应和纳米材料合成机制提供了新的视角，同时也拓展了TRA ICP-MS技术的应用范围。

### 方法的创新与优化

为了在高盐度条件下实现对单个细胞的稳定检测，研究团队对多种样品引入系统进行了详细测试与优化。这些系统包括单次通过喷雾室（Single-pass Spray Chamber, SPC）和双次通过喷雾室（Double-pass Spray Chamber, DPC）等。通过比较不同配置下的信号强度和传输效率，团队发现双次通过喷雾室能够更有效地过滤掉盐分，从而减少对检测信号的干扰。同时，使用高效率雾化器（High-Efficiency Nebulizer, HEN）搭配双次通过喷雾室的组合，在保持信号稳定性的同时，也提供了较高的检测灵敏度。

此外，为了进一步降低基质负载并避免细胞裂解，研究还引入了在线稀释策略。通过T型连接器将样品与稀释剂（如超纯水）在进入等离子体前进行混合，使得稀释比例能够达到1:1000，这在不影响细胞结构的前提下有效降低了TDS浓度。与传统的离线稀释方法相比，这种在线稀释技术不仅提高了操作效率，还确保了细胞在稀释过程中的完整性，从而避免了由于细胞裂解而导致的信号重叠或失真。

在实验过程中，团队还对不同稀释条件下的信号稳定性进行了评估。通过使用Au纳米颗粒作为基准，团队发现，在使用HEN-DP系统时，即使在高盐度条件下，也能获得较为稳定的信号。而HEN-SP系统虽然在无盐情况下具有较高的传输效率，但在高盐度条件下容易受到基质效应的影响，导致信号波动较大。因此，HEN-DP系统被选为最佳配置，以兼顾信号稳定性和基质耐受性。

### 实验结果与讨论

通过上述优化方法，研究团队对**H. mediterranei**在不同处理条件下的细胞进行了时间分辨分析。首先，对未添加任何外源元素的细胞进行了检测，以评估其内源性微量元素的含量。结果显示，Cu、Mn和Zn等元素在细胞中的浓度均低于检测限，表明在自然状态下，这些元素的含量不足以被TRA ICP-TOFMS技术可靠检测。这一结果也表明，基质效应在高盐度条件下对检测灵敏度有显著影响，因此需要对稀释策略进行进一步优化。

在Pb暴露实验中，研究团队发现单个细胞的Pb富集表现出高度的异质性，其浓度范围从20到300 ag/cell。这种异质性可能与细胞对重金属的吸收机制有关，也可能受到环境因素（如培养基成分、温度、pH值等）的影响。此外，Pb的检测限为15 ag/cell，表明该方法在低浓度Pb的检测方面具有较高的灵敏度。

当**H. mediterranei**同时暴露于Pb和Se时，研究团队观察到了Pb与Se的共检测现象。这一现象表明，Se纳米颗粒可能位于细胞内部，而不是被释放到培养基中。通过对共检测事件的统计分析，团队发现约15.8%的Pb事件与Se同时发生，而仅有16.9%的Se事件是独立存在的。这说明Se纳米颗粒主要与Pb共存于细胞内部，而不是作为自由悬浮的纳米颗粒存在于培养基中。这一发现为理解嗜盐微生物在重金属和纳米材料共存条件下的生理反应提供了重要依据。

同时，研究团队还对Se纳米颗粒的大小进行了测量。结果表明，Se纳米颗粒的尺寸范围在47至73 nm之间，与之前的实验结果有所不同。这种差异可能与实验条件（如培养基成分、pH值、氧分压等）有关。例如，早期的研究在混合有氧和无氧条件下进行，而本研究选择了纯有氧条件，这可能影响了Se纳米颗粒的形成和大小分布。因此，培养条件的选择对纳米颗粒的特性具有重要影响。

### 方法的意义与应用前景

本研究提出的方法在分析高盐度环境中微生物和纳米颗粒时具有重要的应用价值。首先，它为嗜盐微生物的单细胞分析提供了一种无需复杂预处理的解决方案，从而提高了分析的效率和可靠性。其次，该方法能够有效区分细胞与纳米颗粒的信号，避免了因基质干扰而导致的误判。此外，通过时间分辨分析，团队能够观察到单个细胞在不同环境条件下的动态变化，这为研究微生物的生物富集机制和纳米颗粒的生物合成过程提供了新的工具。

在生物修复和纳米材料生产领域，**H. mediterranei**作为一种具有潜力的嗜盐微生物，其对重金属和硒的代谢能力备受关注。本研究通过TRI-ICP-TOFMS技术，不仅能够监测Pb的富集情况，还能追踪Se纳米颗粒的形成过程。这种多元素检测能力使得研究者能够更全面地了解微生物在复杂环境中的行为，为生物修复技术的优化和纳米材料的规模化生产提供了理论支持。

### 实验设计与操作细节

在实验设计方面，团队采用了多种方法以确保分析的准确性和可重复性。首先，他们对不同样品引入系统进行了对比实验，以确定最佳配置。其次，他们对稀释策略进行了系统优化，通过在线稀释和离线稀释的结合，既降低了基质干扰，又避免了细胞裂解。此外，为了验证方法的可靠性，团队还使用了Au纳米颗粒作为标准物质，对不同稀释条件下的信号强度和传输效率进行了评估。

在数据分析方面，团队采用了基于粒子大小的校准方法，通过将标准纳米颗粒与元素标准溶液进行比较，建立了信号强度与元素质量之间的关系。这种方法不仅提高了检测的准确性，还使得研究者能够对纳米颗粒的分布情况进行更精确的描述。同时，通过统计分析，团队能够区分单个细胞事件和共检测事件，从而更清晰地理解纳米颗粒与细胞之间的相互作用。

### 未来研究方向

尽管本研究已经取得了重要的进展，但仍有一些问题值得进一步探讨。例如，Se纳米颗粒的检测限较低，可能导致部分小尺寸颗粒被遗漏，从而影响对纳米颗粒总量的准确评估。此外，Pb和Se的共检测事件虽然表明纳米颗粒可能位于细胞内部，但还需要进一步的实验来确认这一结论。例如，通过细胞活力实验或其他生物化学手段，可以更直接地评估Se对Pb毒性的影响。

此外，研究团队还发现，**H. mediterranei**在有氧和无氧条件下的纳米颗粒大小分布存在显著差异。这一现象提示我们，培养条件的选择对纳米颗粒的形成和特性具有重要影响。因此，未来的研究可以进一步探索不同培养条件对纳米颗粒合成的影响，以优化其生产过程。

综上所述，本研究提出了一种适用于高盐度环境下的时间分辨ICP-MS分析方法，为嗜盐微生物的单细胞研究提供了新的思路和技术手段。通过优化样品引入系统和稀释策略，团队成功克服了高盐度带来的基质效应，使得能够对Pb的生物富集和Se纳米颗粒的形成进行精确监测。这一方法不仅具有理论意义，还为实际应用（如生物修复和纳米材料生产）提供了重要的支持。