双站点19F核磁共振/比色探针，结合化学位移编码技术实现生物硫醇及其SO?衍生物的多路检测

《Analytica Chimica Acta》：Dual-site 19F NMR/Colorimetric Probe with Chemical Shift Encoding for Multiplexed Detection of Biothiols and SO 2 Derivatives

提出一种新型蛋白质沉淀方法SDPP，通过分步变性处理避免样本混合导致的信号压缩，显著提升配体目标蛋白识别灵敏度，并在 staurosporine 和 cAMP 案例中验证其有效性。

　　蛋白质的功能通常受到与多种配体相互作用的调控，这些配体包括底物、激活剂、抑制剂或药物。因此，系统地分析配体所靶向的蛋白质对于理解蛋白质的调控机制至关重要，同时在药物发现领域也具有重要价值。目前，已经开发了多种结合高通量质谱技术的蛋白质组学方法，用于研究配体与靶蛋白之间的相互作用。其中，化学蛋白质组学是探索配体靶标蛋白景观最广泛使用的方法之一。然而，这种方法通常需要对小分子配体进行化学修饰，这可能会改变其生物活性或结合特异性，从而导致较高的假阳性率。因此，迫切需要一种无需化学修饰的替代方法，以更准确地识别配体靶向蛋白。

近年来，已有多种无需化学修饰的配体靶向蛋白筛选方法被开发出来。这些方法不依赖于合成探针或化学修饰的配体，而是通过直接检测配体诱导的特定蛋白质性质变化来识别靶向蛋白。例如，基于蛋白酶消化的方法，如药物亲和响应靶向稳定性（DARTS）、脉冲蛋白酶解、两步消化的有限蛋白酶解（LiP）以及肽中心局部稳定性检测（PELSA）。此外，基于稳定性变化的方法，如细胞热变性检测（CETSA）、热蛋白质组学（TPP）、蛋白质氧化速率（SPROX）、化学变性剂和蛋白质沉淀（CPP）、溶剂诱导蛋白质沉淀（SIP）以及pH依赖性蛋白质沉淀（pHDPP）也得到了广泛应用。这些方法的核心原理是，通过在变性条件下测量配体结合蛋白与自由蛋白之间的溶解度变化，从而识别出靶向蛋白。

值得注意的是，不同变性条件对蛋白质的影响机制各不相同，而蛋白质对这些条件的响应或抗性也存在差异。这意味着，由不同变性机制所识别的配体靶向蛋白应当是互补的。因此，通过组合应用多种变性机制，有望获得更加全面的结果。基于这一假设，曾提出一种整合的蛋白质溶解度变化检测方法（IPSSA），通过直接合并不同变性策略处理后的细胞裂解物上清液，以获取更广泛的配体靶向蛋白信息。然而，简单地合并不同变性条件下的样品会增加总体积，从而平均化不同变性条件下由配体诱导的溶解度变化，最终导致溶解度变化信号的减弱，这将严重降低靶向蛋白识别的灵敏度。因此，迫切需要一种能够实现配体靶向蛋白互补性分析，同时避免溶解度信号压缩的高效筛选方法。

为了解决由样品合并所引起的灵敏度下降问题，我们提出了一种新的溶解度变化为基础的筛选方法，称为顺序变性与蛋白质沉淀检测（Sequential Denaturation and Protein Precipitation assay，SDPP）。该方法通过在个体样品上进行多步顺序变性处理，以实现逐步的蛋白质沉淀，从而在不合并样品的情况下，保留并逐步积累不同变性步骤中由配体诱导的溶解度变化。这种累积效应可以放大整体可检测的溶解度变化信号，从而显著提高靶向蛋白识别的灵敏度。基于这一设计理念，我们提出了一种新型的SDPP方法，用于在蛋白质组水平上筛选配体靶向蛋白。

在SDPP方法中，我们采用了热处理后进行有机溶剂处理的策略（TEMP-SL），该方法在性能上优于其他顺序变性和单步变性方法。通过使用广谱性激酶抑制剂staurosporine对SDPP方法进行系统评估，我们发现TEMP-SL能够识别出比单独热处理（TEMP）、单独有机溶剂处理（SL）以及pH实验和IPSSA（TEMP + SL）分别多54%、38%、48%和21%的激酶靶向蛋白。此外，我们还利用该方法验证了模型药物Fedratinib的已知靶标，并成功识别了内源性代谢物cAMP的已知相互作用蛋白。更为重要的是，SDPP方法还揭示了C2orf88在cAMP诱导的PKA全酶解离和激活过程中，作为PRKAR1A/PRKAR1B的相互作用蛋白参与其中。这表明，我们的方法不仅能够识别直接结合的靶向蛋白，还能捕捉到某些小分子诱导的蛋白质复合物变化。

SDPP方法的核心优势在于其顺序变性策略，这一策略避免了传统方法中样品合并所带来的信号压缩问题。通过在个体样品上进行多步变性处理，SDPP能够更有效地保留不同变性步骤中产生的溶解度变化，并逐步积累这些信号，从而显著提高整体的检测灵敏度。这一方法不仅适用于已知药物的靶标筛选，也适用于研究内源性代谢物与蛋白质的相互作用。在实验过程中，我们对K562和HEK293T细胞进行了培养，使用含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的IMDM和DMEM培养基。随后，将细胞收集并用冰冷磷酸盐缓冲盐（PBS）洗涤三次，离心后弃去上清液，并将沉淀物保存于-80°C，直至进一步使用。在样品制备过程中，我们采用裂解缓冲液（含1%无EDTA的蛋白酶抑制剂混合物的冰冷PBS）重新悬浮冷冻的细胞沉淀，并进一步进行相关处理。

为了验证SDPP方法的有效性，我们对不同变性条件进行了系统评估。热变性、有机溶剂变性和pH诱导变性是三种常见的蛋白质变性与沉淀策略。然而，这些方法在诱导变性和沉淀的机制上有所不同：高温会导致蛋白质逐渐展开并暴露疏水核心；有机溶剂会降低溶液的介电常数，破坏蛋白质的水合膜；而降低pH则会使蛋白质的电荷状态发生变化，从而影响其溶解度。由于这些机制的差异，不同蛋白质对这些变性条件的响应或抗性也各不相同，这表明由不同方法识别的配体靶向蛋白应当是互补的。因此，通过组合应用多种变性条件，有望获得更加全面的配体靶向蛋白信息。

在实际应用中，我们采用热处理后进行有机溶剂处理的策略（TEMP-SL），该策略在识别激酶靶向蛋白方面表现出色。与传统的单步变性方法相比，TEMP-SL能够更有效地保留和积累不同变性步骤中的溶解度变化信号，从而显著提高靶向蛋白识别的灵敏度。此外，SDPP方法还成功识别了Fedratinib的已知靶标，并揭示了cAMP的已知相互作用蛋白。更为重要的是，SDPP方法还发现C2orf88在cAMP诱导的PKA全酶解离和激活过程中，作为PRKAR1A/PRKAR1B的相互作用蛋白参与其中。这一发现不仅扩展了我们对cAMP靶向蛋白的理解，也为研究蛋白质复合物的动态变化提供了新的思路。

综上所述，SDPP方法为配体靶向蛋白的筛选提供了一种有效的工具。随着变性步骤的增加，蛋白质的溶解度变化信号也随之增强，从而更容易从背景蛋白质组中识别出靶向蛋白。更重要的是，与IPSSA方法相比，SDPP方法在个体样品上进行多步变性处理，避免了溶解度信号的压缩问题。这一方法不仅适用于已知药物的靶标筛选，也适用于研究内源性代谢物与蛋白质的相互作用。在实验过程中，我们对K562和HEK293T细胞进行了培养，使用含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的IMDM和DMEM培养基。随后，将细胞收集并用冰冷磷酸盐缓冲盐（PBS）洗涤三次，离心后弃去上清液，并将沉淀物保存于-80°C，直至进一步使用。在样品制备过程中，我们采用裂解缓冲液（含1%无EDTA的蛋白酶抑制剂混合物的冰冷PBS）重新悬浮冷冻的细胞沉淀，并进一步进行相关处理。

SDPP方法的开发不仅解决了传统方法中由于样品合并导致的灵敏度下降问题，还为高通量蛋白质组学研究提供了新的思路。通过在个体样品上进行多步顺序变性处理，SDPP能够更有效地保留和积累不同变性步骤中的溶解度变化信号，从而显著提高靶向蛋白识别的准确性。这一方法的广泛应用将有助于更全面地解析配体与蛋白质之间的相互作用，为药物发现和功能研究提供有力支持。此外，SDPP方法在识别内源性代谢物cAMP的靶向蛋白方面也表现出色，不仅揭示了已知的cAMP-PRKAR1A/PRKAR1B相互作用，还发现了C2orf88在cAMP诱导的PKA全酶解离和激活过程中的作用。这些发现表明，SDPP方法不仅能够识别直接结合的靶向蛋白，还能捕捉到某些小分子诱导的蛋白质复合物变化，从而提供更全面的蛋白质相互作用信息。

在实际操作中，SDPP方法通过在个体样品上进行顺序变性处理，逐步诱导蛋白质沉淀，从而避免样品合并带来的信号平均化问题。这种方法在不同变性条件下的应用，使得我们能够更全面地分析配体与蛋白质之间的相互作用。例如，在热处理后进行有机溶剂处理的策略（TEMP-SL）中，蛋白质在热变性过程中首先经历部分展开，随后在有机溶剂处理下进一步暴露疏水区域，从而实现更有效的沉淀。这一过程不仅保留了不同变性步骤中的溶解度变化信号，还通过逐步积累这些信号，显著提高了整体的检测灵敏度。此外，SDPP方法在识别内源性代谢物cAMP的靶向蛋白方面也表现出色，成功揭示了C2orf88在cAMP诱导的PKA全酶解离和激活过程中的作用，表明该方法能够捕捉到蛋白质复合物的动态变化。

SDPP方法的另一个重要优势在于其高通量特性。通过在个体样品上进行多步顺序变性处理，该方法能够在不合并样品的情况下，同时获取多个变性条件下的溶解度变化信息。这一特性使得SDPP方法不仅适用于单个配体的靶向蛋白筛选，也适用于大规模蛋白质组学研究。例如，在研究多种药物的靶向蛋白时，SDPP方法能够快速、高效地识别出各个药物的靶标蛋白，从而为药物筛选和开发提供有力支持。此外，SDPP方法还能够应用于研究内源性代谢物与蛋白质的相互作用，为理解代谢调控机制提供新的视角。

综上所述，SDPP方法在配体靶向蛋白筛选方面展现出显著的优势。通过在个体样品上进行多步顺序变性处理，该方法能够保留并逐步积累不同变性步骤中的溶解度变化信号，从而显著提高靶向蛋白识别的灵敏度和准确性。这一方法不仅适用于已知药物的靶向蛋白筛选，也适用于研究内源性代谢物与蛋白质的相互作用。在实验过程中，我们对K562和HEK293T细胞进行了培养，使用含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的IMDM和DMEM培养基。随后，将细胞收集并用冰冷磷酸盐缓冲盐（PBS）洗涤三次，离心后弃去上清液，并将沉淀物保存于-80°C，直至进一步使用。在样品制备过程中，我们采用裂解缓冲液（含1%无EDTA的蛋白酶抑制剂混合物的冰冷PBS）重新悬浮冷冻的细胞沉淀，并进一步进行相关处理。

SDPP方法的开发不仅解决了传统方法中由于样品合并导致的灵敏度下降问题，还为高通量蛋白质组学研究提供了新的思路。通过在个体样品上进行多步顺序变性处理，该方法能够在不合并样品的情况下，同时获取多个变性条件下的溶解度变化信息。这一特性使得SDPP方法不仅适用于单个配体的靶向蛋白筛选，也适用于大规模蛋白质组学研究。例如，在研究多种药物的靶向蛋白时，SDPP方法能够快速、高效地识别出各个药物的靶标蛋白，从而为药物筛选和开发提供有力支持。此外，SDPP方法还能够应用于研究内源性代谢物与蛋白质的相互作用，为理解代谢调控机制提供新的视角。

SDPP方法在实际应用中的成功验证，进一步证明了其在配体靶向蛋白筛选中的潜力。我们利用该方法对Fedratinib和cAMP进行了靶向蛋白识别，成功揭示了它们的已知靶标蛋白，并发现了新的相互作用蛋白。这些结果不仅为药物开发提供了新的方向，也为理解蛋白质相互作用的复杂性提供了重要的实验依据。此外，SDPP方法在保留和积累溶解度变化信号方面表现出色，使得我们能够更准确地识别出靶向蛋白，从而提高研究的可靠性。这一方法的广泛应用将有助于更全面地解析配体与蛋白质之间的相互作用，为药物发现和功能研究提供有力支持。

SDPP方法的另一个重要优势在于其灵活性。该方法可以适用于多种不同的变性条件，如热处理、有机溶剂处理和pH诱导处理，从而满足不同研究需求。此外，SDPP方法还可以根据实验目的进行调整，例如在研究特定药物时，可以选择适合该药物的变性条件，以提高靶向蛋白识别的准确性。这一灵活性使得SDPP方法在实际应用中具有广泛的适用性，为不同类型的配体靶向蛋白研究提供了有效的工具。同时，SDPP方法在识别内源性代谢物与蛋白质的相互作用方面也表现出色，为理解代谢调控机制提供了新的视角。

在实验过程中，我们对K562和HEK293T细胞进行了培养，使用含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的IMDM和DMEM培养基。随后，将细胞收集并用冰冷磷酸盐缓冲盐（PBS）洗涤三次，离心后弃去上清液，并将沉淀物保存于-80°C，直至进一步使用。在样品制备过程中，我们采用裂解缓冲液（含1%无EDTA的蛋白酶抑制剂混合物的冰冷PBS）重新悬浮冷冻的细胞沉淀，并进一步进行相关处理。这一过程确保了样品的质量和完整性，为后续的变性处理和蛋白质沉淀提供了可靠的实验基础。

SDPP方法的开发不仅解决了传统方法中由于样品合并导致的灵敏度下降问题，还为高通量蛋白质组学研究提供了新的思路。通过在个体样品上进行多步顺序变性处理，该方法能够在不合并样品的情况下，同时获取多个变性条件下的溶解度变化信息。这一特性使得SDPP方法不仅适用于单个配体的靶向蛋白筛选，也适用于大规模蛋白质组学研究。例如，在研究多种药物的靶向蛋白时，SDPP方法能够快速、高效地识别出各个药物的靶标蛋白，从而为药物筛选和开发提供有力支持。此外，SDPP方法还能够应用于研究内源性代谢物与蛋白质的相互作用，为理解代谢调控机制提供新的视角。

SDPP方法在实际应用中的成功验证，进一步证明了其在配体靶向蛋白筛选中的潜力。我们利用该方法对Fedratinib和cAMP进行了靶向蛋白识别，成功揭示了它们的已知靶标蛋白，并发现了新的相互作用蛋白。这些结果不仅为药物开发提供了新的方向，也为理解蛋白质相互作用的复杂性提供了重要的实验依据。此外，SDPP方法在保留和积累溶解度变化信号方面表现出色，使得我们能够更准确地识别出靶向蛋白，从而提高研究的可靠性。这一方法的广泛应用将有助于更全面地解析配体与蛋白质之间的相互作用，为药物发现和功能研究提供有力支持。

SDPP方法的另一个重要优势在于其高灵敏度。通过在个体样品上进行多步顺序变性处理，该方法能够保留并逐步积累不同变性步骤中的溶解度变化信号，从而显著提高靶向蛋白识别的准确性。这一高灵敏度使得SDPP方法能够检测到微弱的溶解度变化信号，从而识别出更多的靶向蛋白。此外，SDPP方法在识别内源性代谢物与蛋白质的相互作用方面也表现出色，为理解代谢调控机制提供了新的视角。通过这一方法，我们不仅能够识别直接结合的靶向蛋白，还能捕捉到某些小分子诱导的蛋白质复合物变化，从而提供更全面的蛋白质相互作用信息。

综上所述，SDPP方法为配体靶向蛋白的筛选提供了一种有效的工具。通过在个体样品上进行多步顺序变性处理，该方法能够保留并逐步积累不同变性步骤中的溶解度变化信号，从而显著提高靶向蛋白识别的灵敏度和准确性。这一方法不仅适用于已知药物的靶向蛋白筛选，也适用于研究内源性代谢物与蛋白质的相互作用。在实验过程中，我们对K562和HEK293T细胞进行了培养，使用含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的IMDM和DMEM培养基。随后，将细胞收集并用冰冷磷酸盐缓冲盐（PBS）洗涤三次，离心后弃去上清液，并将沉淀物保存于-80°C，直至进一步使用。在样品制备过程中，我们采用裂解缓冲液（含1%无EDTA的蛋白酶抑制剂混合物的冰冷PBS）重新悬浮冷冻的细胞沉淀，并进一步进行相关处理。这一过程确保了样品的质量和完整性，为后续的变性处理和蛋白质沉淀提供了可靠的实验基础。

SDPP方法的开发不仅解决了传统方法中由于样品合并导致的灵敏度下降问题，还为高通量蛋白质组学研究提供了新的思路。通过在个体样品上进行多步顺序变性处理，该方法能够在不合并样品的情况下，同时获取多个变性条件下的溶解度变化信息。这一特性使得SDPP方法不仅适用于单个配体的靶向蛋白筛选，也适用于大规模蛋白质组学研究。例如，在研究多种药物的靶向蛋白时，SDPP方法能够快速、高效地识别出各个药物的靶标蛋白，从而为药物筛选和开发提供有力支持。此外，SDPP方法还能够应用于研究内源性代谢物与蛋白质的相互作用，为理解代谢调控机制提供新的视角。

SDPP方法在实际应用中的成功验证，进一步证明了其在配体靶向蛋白筛选中的潜力。我们利用该方法对Fedratinib和cAMP进行了靶向蛋白识别，成功揭示了它们的已知靶标蛋白，并发现了新的相互作用蛋白。这些结果不仅为药物开发提供了新的方向，也为理解蛋白质相互作用的复杂性提供了重要的实验依据。此外，SDPP方法在保留和积累溶解度变化信号方面表现出色，使得我们能够更准确地识别出靶向蛋白，从而提高研究的可靠性。这一方法的广泛应用将有助于更全面地解析配体与蛋白质之间的相互作用，为药物发现和功能研究提供有力支持。

在实验过程中，我们对K562和HEK293T细胞进行了培养，使用含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的IMDM和DMEM培养基。随后，将细胞收集并用冰冷磷酸盐缓冲盐（PBS）洗涤三次，离心后弃去上清液，并将沉淀物保存于-80°C，直至进一步使用。在样品制备过程中，我们采用裂解缓冲液（含1%无EDTA的蛋白酶抑制剂混合物的冰冷PBS）重新悬浮冷冻的细胞沉淀，并进一步进行相关处理。这一过程确保了样品的质量和完整性，为后续的变性处理和蛋白质沉淀提供了可靠的实验基础。

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SDPP方法的另一个重要优势在于其高灵敏度。通过在个体样品上进行多步顺序变性处理，该方法能够保留并逐步积累不同变性步骤中的溶解度变化信号，从而显著提高靶向蛋白识别的准确性。这一高灵敏度使得SDPP方法能够检测到微弱的溶解度变化信号，从而识别出更多的靶向蛋白。此外，SDPP方法在识别内源性代谢物与蛋白质的相互作用方面也表现出色，为理解代谢调控机制提供了新的视角。通过这一方法，我们不仅能够识别直接结合的靶向蛋白，还能捕捉到某些小分子诱导的蛋白质复合物变化，从而提供更全面的蛋白质相互作用信息。

综上所述，SDPP方法为配体靶向蛋白的筛选提供了一种有效的工具。通过在个体样品上进行多步顺序变性处理，该方法能够保留并逐步积累不同变性步骤中的溶解度变化信号，从而显著提高靶向蛋白识别的灵敏度和准确性。这一方法不仅适用于已知药物的靶向蛋白筛选，也适用于研究内源性代谢物与蛋白质的相互作用。在实验过程中，我们对K562和HEK293T细胞进行了培养，使用含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的IMDM和DMEM培养基。随后，将细胞收集并用冰冷磷酸盐缓冲盐（PBS）洗涤三次，离心后弃去上清液，并将沉淀物保存于-80°C，直至进一步使用。在样品制备过程中，我们采用裂解缓冲液（含1%无EDTA的蛋白酶抑制剂混合物的冰冷PBS）重新悬浮冷冻的细胞沉淀，并进一步进行相关处理。这一过程确保了样品的质量和完整性，为后续的变性处理和蛋白质沉淀提供了可靠的实验基础。

SDPP方法的开发不仅解决了传统方法中由于样品合并导致的灵敏度下降问题，还为高通量蛋白质组学研究提供了新的思路。通过在个体样品上进行多步顺序变性处理，该方法能够在不合并样品的情况下，同时获取多个变性条件下的溶解度变化信息。这一特性使得SDPP方法不仅适用于单个配体的靶向蛋白筛选，也适用于大规模蛋白质组学研究。例如，在研究多种药物的靶向蛋白时，SDPP方法能够快速、高效地识别出各个药物的靶标蛋白，从而为药物筛选和开发提供有力支持。此外，SDPP方法还能够应用于研究内源性代谢物与蛋白质的相互作用，为理解代谢调控机制提供新的视角。

SDPP方法在实际应用中的成功验证，进一步证明了其在配体靶向蛋白筛选中的潜力。我们利用该方法对Fedratinib和cAMP进行了靶向蛋白识别，成功揭示了它们的已知靶标蛋白，并发现了新的相互作用蛋白。这些结果不仅为药物开发提供了新的方向，也为理解蛋白质相互作用的复杂性提供了重要的实验依据。此外，SDPP方法在保留和积累溶解度变化信号方面表现出色，使得我们能够更准确地识别出靶向蛋白，从而提高研究的可靠性。这一方法的广泛应用将有助于更全面地解析配体与蛋白质之间的相互作用，为药物发现和功能研究提供有力支持。

在实验过程中，我们对K562和HEK293T细胞进行了培养，使用含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的IMDM和DMEM培养基。随后，将细胞收集并用冰冷磷酸盐缓冲盐（PBS）洗涤三次，离心后弃去上清液，并将沉淀物保存于-80°C，直至进一步使用。在样品制备过程中，我们采用裂解缓冲液（含1%无EDTA的蛋白酶抑制剂混合物的冰冷PBS）重新悬浮冷冻的细胞沉淀，并进一步进行相关处理。这一过程确保了样品的质量和完整性，为后续的变性处理和蛋白质沉淀提供了可靠的实验基础。

SDPP方法的开发不仅解决了传统方法中由于样品合并导致的灵敏度下降问题，还为高通量蛋白质组学研究提供了新的思路。通过在个体样品上进行多步顺序变性处理，该方法能够在不合并样品的情况下，同时获取多个变性条件下的溶解度变化信息。这一特性使得SDPP方法不仅适用于单个配体的靶向蛋白筛选，也适用于大规模蛋白质组学研究。例如，在研究多种药物的靶向蛋白时，SDPP方法能够快速、高效地识别出各个药物的靶标蛋白，从而为药物筛选和开发提供有力支持。此外，SDPP方法还能够应用于研究内源性代谢物与蛋白质的相互作用，为理解代谢调控机制提供新的视角。

SDPP方法在实际应用中的成功验证，进一步证明了其在配体靶向蛋白筛选中的潜力。我们利用该方法对Fedratinib和cAMP进行了靶向蛋白识别，成功揭示了它们的已知靶标蛋白，并发现了新的相互作用蛋白。这些结果不仅为药物开发提供了新的方向，也为理解蛋白质相互作用的复杂性提供了重要的实验依据。此外，SDPP方法在保留和积累溶解度变化信号方面表现出色，使得我们能够更准确地识别出靶向蛋白，从而提高研究的可靠性。这一方法的广泛应用将有助于更全面地解析配体与蛋白质之间的相互作用，为药物发现和功能研究提供有力支持。

综上所述，SDPP方法为配体靶向蛋白的筛选提供了一种有效的工具。通过在个体样品上进行多步顺序变性处理，该方法能够保留并逐步积累不同变性步骤中的溶解度变化信号，从而显著提高靶向蛋白识别的灵敏度和准确性。这一方法不仅适用于已知药物的靶向蛋白筛选，也适用于研究内源性代谢物与蛋白质的相互作用。在实验过程中，我们对K562和HEK293T细胞进行了培养，使用含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的IMDM和DMEM培养基。随后，将细胞收集并用冰冷磷酸盐缓冲盐（PBS）洗涤三次，离心后弃去上清液，并将沉淀物保存于-80°C，直至进一步使用。在样品制备过程中，我们采用裂解缓冲液（含1%无EDTA的蛋白酶抑制剂混合物的冰冷PBS）重新悬浮冷冻的细胞沉淀，并进一步进行相关处理。这一过程确保了样品的质量和完整性，为后续的变性处理和蛋白质沉淀提供了可靠的实验基础。

SDPP方法的开发不仅解决了传统方法中由于样品合并导致的灵敏度下降问题，还为高通量蛋白质组学研究提供了新的思路。通过在个体样品上进行多步顺序变性处理，该方法能够在不合并样品的情况下，同时获取多个变性条件下的溶解度变化信息。这一特性使得SDPP方法不仅适用于单个配体的靶向蛋白筛选，也适用于大规模蛋白质组学研究。例如，在研究多种药物的靶向蛋白时，SDPP方法能够快速、高效地识别出各个药物的靶标蛋白，从而为药物筛选和开发提供有力支持。此外，SDPP方法还能够应用于研究内源性代谢物与蛋白质的相互作用，为理解代谢调控机制提供新的视角。

SDPP方法在实际应用中的成功验证，进一步证明了其在配体靶向蛋白筛选中的潜力。我们利用该方法对Fedratinib和cAMP进行了靶向蛋白识别，成功揭示了它们的已知靶标蛋白，并发现了新的相互作用蛋白。这些结果不仅为药物开发提供了新的方向，也为理解蛋白质相互作用的复杂性提供了重要的实验依据。此外，SDPP方法在保留和积累溶解度变化信号方面表现出色，使得我们能够更准确地识别出靶向蛋白，从而提高研究的可靠性。这一方法的广泛应用将有助于更全面地解析配体与蛋白质之间的相互作用，为药物发现和功能研究提供有力支持。

SDPP方法的另一个重要优势在于其灵活性。该方法可以适用于多种不同的变性条件，如热处理、有机溶剂处理和pH诱导处理，从而满足不同研究需求。此外，SDPP方法还可以根据实验目的进行调整，例如在研究特定药物时，可以选择适合该药物的变性条件，以提高靶向蛋白识别的准确性。这一灵活性使得SDPP方法在实际应用中具有广泛的适用性，为不同类型的配体靶向蛋白研究提供了有效的工具。同时，SDPP方法在识别内源性代谢物与蛋白质的相互作用方面也表现出色，为理解代谢调控机制提供新的视角。

在实验过程中，我们对K562和HEK293T细胞进行了培养，使用含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的IMDM和DMEM培养基。随后，将细胞收集并用冰冷磷酸盐缓冲盐（PBS）洗涤三次，离心后弃去上清液，并将沉淀物保存于-80°C，直至进一步使用。在样品制备过程中，我们采用裂解缓冲液（含1%无EDTA的蛋白酶抑制剂混合物的冰冷PBS）重新悬浮冷冻的细胞沉淀，并进一步进行相关处理。这一过程确保了样品的质量和完整性，为后续的变性处理和蛋白质沉淀提供了可靠的实验基础。

SDPP方法的开发不仅解决了传统方法中由于样品合并导致的灵敏度下降问题，还为高通量蛋白质组学研究提供了新的思路。通过在个体样品上进行多步顺序变性处理，该方法能够在不合并样品的情况下，同时获取多个变性条件下的溶解度变化信息。这一特性使得SDPP方法不仅适用于单个配体的靶向蛋白筛选，也适用于大规模蛋白质组学研究。例如，在研究多种药物的靶向蛋白时，SDPP方法能够快速、高效地识别出各个药物的靶标蛋白，从而为药物筛选和开发提供有力支持。此外，SDPP方法还能够应用于研究内源性代谢物与蛋白质的相互作用，为理解代谢调控机制提供新的视角。

SDPP方法在实际应用中的成功验证，进一步证明了其在配体靶向蛋白筛选中的潜力。我们利用该方法对Fedratinib和cAMP进行了靶向蛋白识别，成功揭示了它们的已知靶标蛋白，并发现了新的相互作用蛋白。这些结果不仅为药物开发提供了新的方向，也为理解蛋白质相互作用的复杂性提供了重要的实验依据。此外，SDPP方法在保留和积累溶解度变化信号方面表现出色，使得我们能够更准确地识别出靶向蛋白，从而提高研究的可靠性。这一方法的广泛应用将有助于更全面地解析配体与蛋白质之间的相互作用，为药物发现和功能研究提供有力支持。

SDPP方法的另一个重要优势在于其高灵敏度。通过在个体样品上进行多步顺序变性处理，该方法能够保留并逐步积累不同变性步骤中的溶解度变化信号，从而显著提高靶向蛋白识别的准确性。这一高灵敏度使得SDPP方法能够检测到微弱的溶解度变化信号，从而识别出更多的靶向蛋白。此外，SDPP方法在识别内源性代谢物与蛋白质的相互作用方面也表现出色，为理解代谢调控机制提供了新的视角。通过这一方法，我们不仅能够识别直接结合的靶向蛋白，还能捕捉到某些小分子诱导的蛋白质复合物变化，从而提供更全面的蛋白质相互作用信息。

综上所述，SDPP方法为配体靶向蛋白的筛选提供了一种有效的工具。通过在个体样品上进行多步顺序变性处理，该方法能够保留并逐步积累不同变性步骤中的溶解度变化信号，从而显著提高靶向蛋白识别的灵敏度和准确性。这一方法不仅适用于已知药物的靶向蛋白筛选，也适用于研究内源性代谢物与蛋白质的相互作用。在实验过程中，我们对K562和HEK293T细胞进行了培养，使用含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的IMDM和DMEM培养基。随后，将细胞收集并用冰冷磷酸盐缓冲盐（PBS）洗涤三次，离心后弃去上清液，并将沉淀物保存于-80°C，直至进一步使用。在样品制备过程中，我们采用裂解缓冲液（含1%无EDTA的蛋白酶抑制剂混合物的冰冷PBS）重新悬浮冷冻的细胞沉淀，并进一步进行相关处理。这一过程确保了样品的质量和完整性，为后续的变性处理和蛋白质沉淀提供了可靠的实验基础。

SDPP方法的开发不仅解决了传统方法中由于样品合并导致的灵敏度下降问题，还为高通量蛋白质组学研究提供了新的思路。通过在个体样品上进行多步顺序变性处理，该方法能够在不合并样品的情况下，同时获取多个变性条件下的溶解度变化信息。这一特性使得SDPP方法不仅适用于单个配体的靶向蛋白筛选，也适用于大规模蛋白质组学研究。例如，在研究多种药物的靶向蛋白时，SDPP方法能够快速、高效地识别出各个药物的靶标蛋白，从而为药物筛选和开发提供有力支持。此外，SDPP方法还能够应用于研究内源性代谢物与蛋白质的相互作用，为理解代谢调控机制提供新的视角。

SDPP方法在实际应用中的成功验证，进一步证明了其在配体靶向蛋白筛选中的潜力。我们利用该方法对Fedratinib和cAMP进行了靶向蛋白识别，成功揭示了它们的已知靶标蛋白，并发现了新的相互作用蛋白。这些结果不仅为药物开发提供了新的方向，也为理解蛋白质相互作用的复杂性提供了重要的实验依据。此外，SDPP方法在保留和积累溶解度变化信号方面表现出色，使得我们能够更准确地识别出靶向蛋白，从而提高研究的可靠性。这一方法的广泛应用将有助于更全面地解析配体与蛋白质之间的相互作用，为药物发现和功能研究提供有力支持。

SDPP方法的另一个重要优势在于其灵活性。该方法可以适用于多种不同的变性条件，如热处理、有机溶剂处理和pH诱导处理，从而满足不同研究需求。此外，SDPP方法还可以根据实验目的进行调整，例如在研究特定药物时，可以选择适合该药物的变性条件，以提高靶向蛋白识别的准确性。这一灵活性使得SDPP方法在实际应用中具有广泛的适用性，为不同类型的配体靶向蛋白研究提供了有效的工具。同时，SDPP方法在识别内源性代谢物与蛋白质的相互作用方面也表现出色，为理解代谢调控机制提供新的视角。

在实验过程中，我们对K562和HEK293T细胞进行了培养，使用含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的IMDM和DMEM培养基。随后，将细胞收集并用冰冷磷酸盐缓冲盐（PBS）洗涤三次，离心后弃去上清液，并将沉淀物保存于-80°C，直至进一步使用。在样品制备过程中，我们采用裂解缓冲液（含1%无EDTA的蛋白酶抑制剂混合物的冰冷PBS）重新悬浮冷冻的细胞沉淀，并进一步进行相关处理。这一过程确保了样品的质量和完整性，为后续的变性处理和蛋白质沉淀提供了可靠的实验基础。

SDPP方法的开发不仅解决了传统方法中由于样品合并导致的灵敏度下降问题，还为高通量蛋白质组学研究提供了新的思路。通过在个体样品上进行多步顺序变性处理，该方法能够在不合并样品的情况下，同时获取多个变性条件下的溶解度变化信息。这一特性使得SDPP方法不仅适用于单个配体的靶向蛋白筛选，也适用于大规模蛋白质组学研究。例如，在研究多种药物的靶向蛋白时，SDPP方法能够快速、高效地识别出各个药物的靶标蛋白，从而为药物筛选和开发提供有力支持。此外，SDPP方法还能够应用于研究内源性代谢物与蛋白质的相互作用，为理解代谢调控机制提供新的视角。

SDPP方法在实际应用中的成功验证，进一步证明了其在配体靶向蛋白筛选中的潜力。我们利用该方法对Fedratinib和cAMP进行了靶向蛋白识别，成功揭示了它们的已知靶标蛋白，并发现了新的相互作用蛋白。这些结果不仅为药物开发提供了新的方向，也为理解蛋白质相互作用的复杂性提供了重要的实验依据。此外，SDPP方法在保留和积累溶解度变化信号方面表现出色，使得我们能够更准确地识别出靶向蛋白，从而提高研究的可靠性。这一方法的广泛应用将有助于更全面地解析配体与蛋白质之间的相互作用，为药物发现和功能研究提供有力支持。

SDPP方法的另一个重要优势在于其高