硫化物与油酸协同调控电子传递系统促进铜绿假单胞菌MCC 5300中链长度聚羟基脂肪酸酯生物合成及其机制研究

本研究针对传统微生物法生产mcl-PHA存在产量低、周期长的问题，通过添加硫化物与油酸协同调控铜绿假单胞菌MCC 5300的电子传递系统（ETC），使mcl-PHA产量在24小时内达到3.476 g/L（占细胞干重86.5%），揭示了bd氧化酶上调促进NADH消耗和PHA积累的 redox-homeostasis 机制，为高效生物塑料工业化生产提供新策略。

　　

随着石油基塑料对环境的持续污染，开发具有相似力学性能且可生物降解的替代材料成为全球研究热点。聚羟基脂肪酸酯（PHA）是一类由微生物合成的聚酯，其中中链长度PHA（mcl-PHA）因其弹性体特性在医疗和工业领域具有广阔应用前景。然而，野生型菌株产量低、营养限制条件下培养周期长、以及缺氧环境控制成本高等问题严重制约其工业化生产。铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）作为重要的mcl-PHA生产者，其合成机制与细胞能量代谢密切相关，尤其是电子传递系统（ETC）的调控尚未被充分探索。

在此背景下，Raghavendra Paduvari和Divyashree Somashekara团队在《Biochemistry and Biophysics Reports》发表研究，首次揭示了硫化物与油酸协同作用通过调控ETC显著提升mcl-PHA产量的新机制。研究人员采用来自油厂废水的铜绿假单胞菌MCC 5300菌株，在添加38 mM油酸和5 mM硫化物的胰蛋白酶大豆 broth（TSB）富营养培养基中，通过24小时短时培养实现了86.5%细胞干重的mcl-PHA产率。关键技术包括：细胞干重与PHA gravimetric定量、细胞色素c氧化酶（CcO）活性光谱检测、胞内NAD(P)H荧光定量、残留油酸铜皂 spectrophotometric法测定、终端氧化酶基因RT-qPCR表达分析，以及PHA结构的FTIR和¹H NMR表征。

3.1 硫化物对无油酸培养基中细菌生长和PHA生产的影响

在无油酸TSB培养基中，5 mM硫化物虽未显著抑制细菌生长（2.013 g/L vs 对照2.139 g/L），但使PHA产量从0.705 g/L降至0.496 g/L（P=0.203），同时CcO活性升高1.8倍（65.1 μM/min）。表明硫化物在低浓度下通过 sulfide:quinone oxidoreductase（SQR）促进电子流向复合体III和细胞色素c氧化酶，但不足以触发PHA积累。

3.2 油酸与硫化物协同效应对PHA生产的增强

在添加油酸的TSB培养基中，硫化物使菌体生物量增至4.017 g/L，PHA产量达3.476 g/L（对照仅1.339 g/L），且P值0.0025显示显著差异。油酸单独使用可抑制CcO活性39.4倍（0.9 μM/min），而硫化物 addition使活性部分恢复至3.8 μM/min，同时上调bd氧化酶表达。这种协同作用通过加速油酸消耗（残留量1.51 μM vs 对照2.6 μM）和诱导电子分流至bd氧化酶，促进NADH快速消耗，进而驱动PHA合成以维持 redox homeostasis。

3.3 胞内还原辅因子水平与电子传递途径重塑

硫化物使胞内NAD(P)H水平下降3.8倍（25.6 μM vs 对照98.3 μM），油酸单独处理降至37 μM，而油酸+硫化物组略回升至48.3 μM。证明硫化物通过SQR直接提供电子给泛醌池，减少对NADH依赖；油酸则抑制细胞色素c氧化酶，迫使电子转向泛醌氧化酶。PHA作为NADH的"储存库"，在其降解时补充还原力，维持能量生成所需的质子梯度。

3.4 终端氧化酶基因表达调控

RT-qPCR显示油酸下调aa₃氧化酶（2.7倍）、bo₃氧化酶（2.6倍）和bd氧化酶（1.2倍），但cbb₃-2氧化酶不变。硫化物 addition 显著上调cbb₃-1氧化酶（1.3倍）和bd氧化酶（0.9倍），表明细菌通过调整氧化酶表达谱应对电子传递障碍，其中bd氧化酶的 sulfide抗性和高效质子泵能力成为关键适应性策略。

3.5 PHA聚合物结构表征

FTIR和¹H NMR证实产物为典型mcl-PHA：FTIR显示2921-2933 cm^?1处强亚甲基峰；NMR在5.1-5.3 ppm（-CH-O-）、2-2.5 ppm（-CH₂-C=O）和0.8 ppm（-CH₃）出现特征峰，且硫化物未改变聚合物结构，排除其直接参与单体合成的可能性。

本研究创新性地揭示了硫化物与油酸通过双重调控ETC促进mcl-PHA生物合成的机制：油酸抑制细胞色素c氧化酶并引导电子流向泛醌池；硫化物则通过SQR增强电子流，并特异性上调bd氧化酶表达以维持能量代谢，迫使细胞通过积累PHA平衡NADH/NAD⁺比率。该策略突破了传统营养限制培养的瓶颈，在24小时内实现高产率，为工业化生产提供了无需严格缺氧控制、低成本的高效工艺方案。同时，研究深化了对细菌呼吸链可塑性与代谢产物合成耦合机制的理解，为理性设计微生物细胞工厂提供了新视角。