阳离子辅助选择性螯合沉淀纯化酶解木质素的策略及其机制研究

本研究针对酶解木质素(EHL)纯度低、制约其高值化应用的瓶颈问题，开发了一种阳离子辅助选择性螯合沉淀纯化新策略。研究人员系统探究了Ca2+、Mg2+、Fe3+、Al3+四种金属离子对松木、小麦和玉米芯EHL的纯化效果，发现二价离子通过可逆静电相互作用实现选择性沉淀，使木质素纯度提升至90%以上，为木质素的高值化利用提供了高效可行的纯化途径。

　　

在追求可持续发展和绿色化学的今天，木质素作为地球上最丰富的可再生芳香族聚合物，展现出替代化石资源的巨大潜力。然而，酶解木质素（Enzymatic Hydrolysis Lignin, EHL）在实际应用中面临着一个关键瓶颈——纯度不足。原料中残留的碳水化合物、灰分等杂质，特别是在医药和电子材料等高价值领域，会严重影响其性能表现。例如，在药物载体应用中，杂质可能降低载药效率并影响释放性能，从而削弱木质素基递送系统的功能性和有效性。

传统的纯化方法虽然多样，包括物理法（如球磨）、化学法（使用酸、碱、深共熔溶剂DES、有机溶剂和离子液体）以及生物法（使用特定酶），但普遍存在能耗高、成本大、条件苛刻等问题。许多方法需要在接近或超过100°C的高温下进行，导致巨大的能源需求，限制了其大规模应用的可行性。因此，开发低温、高效、经济且环境友好的纯化技术，成为推动木质素高值化利用的迫切需求。

针对这一挑战，发表在《Biomass and Bioenergy》上的研究论文“A cation-assisted purification strategy for enzymatic hydrolysis lignin via selective chelation and precipitation”提出了一种创新的阳离子辅助纯化策略。该研究由华侨大学先进碳转化技术研究院生物质低碳转化福建省重点实验室的Jie Jiang、Chengsi Ouyang、Haiyang Meng、Hao Sun、Changzhou Chen和Jianchun Jiang合作完成。

为了系统评估不同金属阳离子对EHL的纯化效果与机制，研究人员运用了多项关键技术方法。研究选取了来自松木、小麦和玉米芯的四种不同纯度的EHL样本（由国内生物技术公司提供）。核心实验流程包括：将EHL溶解于氢氧化钠溶液后，加入不同浓度的金属氯化物（CaCl₂, MgCl₂, FeCl₃, AlCl₃）溶液，室温搅拌反应后离心分离，酸沉淀并过滤获得木质素-金属（L-M）复合物。对产物的分析采用了国家可再生能源实验室（NREL）方法测定木质素含量和灰分；利用紫外/可见分光光度法（UV/vis spectrophotometry）测定酸溶性木质素；通过傅里叶变换红外光谱（FT-IR）分析官能团变化；运用凝胶渗透色谱（GPC）测定分子量及其分布；采用热重分析（TGA）评估热稳定性；借助扫描电子显微镜（SEM）和X射线光电子能谱（XPS）观察形貌与元素分布及化学状态；利用核磁共振技术（³¹P NMR和二维HSQC NMR）定量官能团及解析结构变化；结合电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）测定金属含量；并采用密度泛函理论（DFT）计算（使用Gaussian 16软件）模拟金属离子与木质素模型的结合能、前沿轨道和静电势（ESP）。

3. Discussion of lignin (pine, wheat, and corn cob) purification

研究系统评估了四种金属氯化物在室温下对三种不同来源EHL（Pine-EHL, Wheat-EHL, Corn-EHL）的纯化效果。结果表明，所有阳离子均能显著提高木质素纯度，但其效率因木质素来源和离子特性而异。对于Pine-EHL，Ca²⁺最为有效，将纯度从40.04%提升至84.68%，显著优于Mg²⁺ (70.53%)、Fe³⁺ (75.70%)和Al³⁺ (58.47%)。值得注意的是，所有体系均存在一个一致的20 g/L最佳凝结剂浓度，表明中等离子强度可通过平衡木质素凝结与杂质沉淀来最大化纯化效率。机理分析表明，阳离子效能的差异源于电荷密度、水合半径和络合能力的差异：二价Ca²⁺通过电荷中和和颗粒间桥接促进最佳木质素聚集，而三价阳离子如Al³⁺和Fe³⁺可能引起过度凝结或氢氧化物沉淀，导致灰分包埋和纯度降低。

FT-IR光谱分析显示，经Ca²⁺纯化后的Pine-EHL在1640 cm^-1处出现明显的羰基伸缩振动峰，这可能是碱性条件下β-O-4键断裂产生更多羟基，后者与Ca²⁺配位所致，这种解聚和结构修饰有助于改性木质素与糖类等杂质分离。对于Wheat-EHL和Corn-EHL，金属离子纯化导致紫丁香基木质素（S）相对丰度增加，并在486 cm^-1处出现木质素-金属螯合物振动模式的新吸收峰。

热重分析表明，木质素的热降解过程分为三个阶段：物理吸附水和溶剂蒸发、醚键（β-O-4等）断裂导致单体和小分子碎片释放、以及木质素碳化。Ca²⁺由于其较大的离子半径和较低的电荷密度，路易斯酸性非常弱，对木质素关键官能团（如酚羟基和羧基）的亲和力有限，所得复合物热稳定性低，配位键可热裂解，因此未显著改变木质素的固有热解行为。相比之下，Al³⁺和Fe³⁺具有更高的电荷密度和更小的离子半径，强烈促进碳化，使碳更多地保留在固体残炭中而非以挥发性气体形式损失，导致热重质量损失曲线更平滑，分解阶段不那么明显。

4. Research on purification mechanism

为深入探究机理，研究采用高纯度（93.65%）玉米芯EHL作为模型材料。纯度测定显示，经Ca²⁺、Mg²⁺和Al³⁺处理后，木质素纯度接近100%，而Fe³⁺纯化后纯度降至79.25%。ICP分析表明，Fe-EHL中的Fe³⁺含量（11.45%）显著高于其他金属（Ca-EHL: 2.44%, Mg-EHL: 1.56%, Al-EHL: 0.89%），这表明Fe³⁺不仅与木质素螯合，还与灰分、半纤维素、糖类等非木质素杂质形成强络合物，这些结合的杂质在后续处理中未被有效去除，最终导致灰分含量增加，纯度降低。

GPC分析表明，纯化后木质素的分子量分布变化最小，但观察到轻微解聚。重均分子量（Mw）从1118 g/mol分别降至1006 g/mol (Ca²⁺)、1030 g/mol (Mg²⁺)、878 g/mol (Fe³⁺)和925 g/mol (Al³⁺)。值得注意的是，Al³⁺纯化木质素的多分散指数（PDI）从2.13显著降至1.91，这归因于Al³⁺在水溶液中的显著水解倾向，形成多羟基桥联阳离子，这些阳离子物种选择性地与高分子量木质素级分络合并促进其从体系中去除，从而降低了PDI。

³¹P NMR定量分析显示，酚羟基和羧基含量在纯化后没有显著变化。相比之下，脂肪族羟基含量大幅下降，从0.41 mmol/L降至0.18 mmol/L (Ca²⁺)、0.15 mmol/L (Mg²⁺)和0.21 mmol/L (Al³⁺)。这些结果表明，脂肪族羟基是木质素结构中参与金属螯合的主要功能位点。

二维HSQC NMR分析表明，在芳香环区域，经金属离子纯化后，S单元含量变化不大，表明金属离子与S单元之间几乎没有螯合。这归因于紫丁香基单元因其酚羟基相邻的两个甲氧基而产生强烈的空间位阻，导致其配位能力明显弱于其他单元。相反，只有Mg²⁺螯合的木质素显示出G单元含量减少，表明只有Mg²⁺选择性地与G单元螯合。在脂肪族侧链区域，金属离子纯化的木质中β-O-4含量明显减少，表明金属离子优先与脂肪族羟基配位。这可以解释为与芳香环相比，脂肪族链具有更大的灵活性和更低的空间位阻，有利于金属离子包封到配位络合物中。

SEM图像显示，经Ca²⁺和Mg²⁺离子处理的木质素呈现尺寸分布相对均匀的明确球形纳米结构。这种结构规整性可能是二价金属离子与木质素官能团之间的配位相互作用的结果，降低了界面能并作为交联位点，促进超分子自组装成纳米球。相比之下，经Fe³⁺和Al³⁺等三价离子纯化的样品呈现无规则形状的聚集块状形态。这种行为可能归因于这些离子与Ca²⁺和Mg²⁺相比具有更高的电荷密度和更强的路易斯酸性，促进了与木质素形成更强和更多的配位键，导致高度交联的三维网络，抑制了球形组装并导致不规则聚集体。元素Mapping分析进一步证实所有金属离子均匀分布在木质素基质中。

XPS分析证实了金属离子的化学状态。Ca 2p光谱显示一个简单的双峰；Mg 1s峰出现在约1304.7 eV的结合能处；Fe 2p XPS光谱显示复杂的多重峰分裂，主峰在711 eV和724 eV，以及719 eV和727 eV处的明显卫星峰，证实了Fe(III)的存在；Al 2p光谱显示结合能为75.0 eV，这明显高于金属铝（72.7 eV）和氧化铝（~74.3 eV），落在铝-有机配位化合物的典型范围内，清楚地表明铝离子不是以物理吸附物种或简单无机沉淀物形式存在，而是与木质素分子中的官能团形成了配位络合物。

DFT计算揭示了相互作用的本质。Al³⁺-木质素复合物显著负的结合能（-326.09 kcal/mol）表明存在强烈的、主要是共价的相互作用，其急剧减少的HOMO-LUMO能隙（1.59 eV）和显示电子密度集中在Al中心周围的异常ESP进一步证明了这一点。这种相互作用太强且非特异性，可能导致不仅木质素，而且半纤维素甚至扭曲的纤维素片段共沉淀，从而降低了分离木质素的选择性和最终纯度。类似地，Fe³⁺具有相当大的结合能（-102.82 kcal/mol）和降低的ΔE（4.69 eV），作为强路易斯酸位点，其高反应性可能促进木质素基质内或与周围碳水化合物的不良催化反应（例如缩合或降解），使分离过程复杂化并引入杂质。相比之下，二价离子Ca²⁺和Mg²⁺表现出明显更弱的、主要是静电/离子性的结合能（分别为-12.51和-24.20 kcal/mol）。它们大的HOMO-LUMO能隙（5.83 eV和5.42 eV）证实了高化学稳定性和低反应性。它们适中的和选择性的相互作用是关键，允许Ca²⁺和Mg²⁺通过温和的分子间桥接有效交联和沉淀木质素分子，同时其低反应性确保它们不会强烈结合或降解碳水化合物部分（纤维素和半纤维素），从而实现更清洁和更具选择性的分离过程，有助于达到90%以上的纯度。

5. Conclusion

该研究成功开发了一种新颖高效的阳离子辅助策略，用于纯化来自不同生物质来源的酶解木质素（EHL）。通过使用二价金属盐如CaCl₂和MgCl₂，实现了木质素纯度的显著提高，对某些底物超过90%，这超越了三价离子的性能，尽管后者具有更高的结合亲和力。机理研究表明，纯化效果不仅仅取决于结合能，而且关键受离子-木质素相互作用性质的控制。二价阳离子促进的适度和可逆的静电相互作用实现了选择性木质素沉淀，而三价离子的强非特异性共价配位导致不希望的交联和碳水化合物共沉淀。这项工作为离子-木质素螯合机制提供了基础见解，并建立了一条实用、高效的途径来获得高纯度木质素，从而解决了一个关键瓶颈，并推进了其在高价值应用中的潜力。

该研究的核心结论在于揭示了“最优的相互作用强度和特异性平衡，而非最大结合亲和力，决定了高效的木质素纯化”。这一发现不仅为木质素纯化工艺提供了新的理论指导和高效可行的技术方案（室温操作、能耗低、效率高），而且其揭示的基于离子价态和相互作用性质（静电 vs. 共价）的选择性沉淀机制，对开发其他生物大分子的分离纯化方法也具有重要的借鉴意义。通过获得高纯度的EHL，为木质素在生物材料、能源、化学品乃至医药等高端领域的价值化应用奠定了坚实的材料基础，有助于减少对化石资源的依赖，提高资源效率和环境效益，促进生态和经济平衡。