基于半理性设计的β-葡萄糖苷酶CaBGL工程化改造及其在纤维素糖化中的增效机制研究

本研究通过构建热稳定绿色荧光蛋白（TGP）高通量筛选平台，结合结构导向的半理性设计策略，成功获得β-葡萄糖苷酶（BGL）突变体M418T。该突变体在葡萄糖抑制环境下催化活性提升2倍以上，纤维素糖化速率系数提高43.27%，为木质纤维素生物炼制提供了高效酶催化剂。

　　

Section snippets

Gene cloning, protein expression, and purification of CaBGL

来自Caldicellulosiruptor sp. F32的CaBGL基因（GenBank编号：KY418041）通过NdeI和XhoI限制性位点克隆至pET28a表达载体，蛋白产物携带N端His₆标签。为结晶实验需求，该基因被克隆至带有SMT3标签的pET28a载体。突变体E163Q和E361Q的表达质粒通过定点突变构建。

Directed evolution of CaBGL for enhanced activity in glucose-rich environments

为实现在高葡萄糖浓度环境下CaBGL突变体的高通量筛选，本研究开发了基于嗜热荧光蛋白（TGP）的定量检测方法。通过将CaBGL与TGP基因融合表达嵌合蛋白CaBGL-TGP，直接利用荧光强度测定实现无需纯化步骤的酶量精准定量。

Conclusion

本研究通过整合TGP高通量筛选与结构引导的半理性设计，成功改造CaBGL并提升其在纤维素糖化中的性能。经定向进化与饱和突变筛选获得的最优突变体M418T，在高葡萄糖浓度下催化活性提升超两倍。结构分析与动力学研究表明，M418T突变通过减少底物结合通道的位阻效应，显著增强了对纤维寡糖的催化效率。该工作不仅为BGL酶的功能优化提供了新策略，更为工业级木质纤维素转化提供了潜力巨大的生物催化剂。