肺炎克雷伯菌高产乙醇酸：代谢通路工程与培养条件优化的突破性研究

本研究通过系统代谢工程策略（包括上调木糖氧化途径（Dahms pathway）、敲除竞争基因（xylA, ackA, pta, yqhD, fucO）及优化培养条件（pH、转速、通气），显著提升肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）利用木糖生产乙醇酸（GA）的效率，最终在补料分批培养中获得70.1 g/L的高产量，为生物可降解塑料（PGA）的可持续生产提供关键技术支持。

　　

Bacterial strains and media

本研究使用的所有菌株和质粒总结于表1。肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）CU衍生自K. pneumoniae ATCC 200721，如先前所述（Oh et al., 2011）。大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α用于质粒维护。基因缺失突变体采用一步失活法构建（Cherepanov and Wackernagel, 1995; Datsenko and Wanner, 2000）。为此，使用质粒pKD46表达重组酶蛋白，并应用pCP20进行选择标记去除。

Up-regulation of the Dahms pathway

为通过Dahms途径提升肺炎克雷伯菌中乙醇酸（GA）的产量，将表达该途径中四个基因——木糖脱氢酶（Xdh）、木糖酸脱水酶（yagF）、2-脱氢-3-脱氧-d-戊酮酸醛缩酶（yagE）和乳醛脱氢酶（aldA）——的pETM-XFEA质粒导入细胞（图2a）。将所得菌株（KPGA0）与亲本菌株（K. pneumoniae CU）在5 L发酵罐中于控制条件（pH 7.0、1.0 vvm、500 rpm）下使用含50 g/L木糖的培养基进行培养比较。野生型菌株未检测到GA或乙二醇（EG），且因木糖通过磷酸戊糖（PP）途径导向细胞生长，仅少量木糖酸积累。相比之下，KPGA0通过外源Dahms途径将木糖转化为GA，产量为4.0 ± 0.3 g/L，并积累19.2 ± 0.9 g/L木糖酸作为中间体，以及3.1 ± 0.2 g/L EG作为副产物。

Deletion of the xylA gene

为增强木糖向木糖酸的转化并增加Dahms途径通量，删除了负责将木糖异构化为木糖酮的xylA基因。所得菌株KPGA1与KPGA0在相同条件下培养。KPGA1的木糖消耗率与KPGA0相似，但木糖酸积累减少（12.1 ± 0.7 g/L），而GA产量增加至5.3 ± 0.4 g/L，提高了1.32倍。此外，EG产量略增至3.4 ± 0.3 g/L。这些结果表明，xylA缺失成功将代谢通量从PP途径重定向至Dahms途径。

Deletion of competing pathway genes

KPGA1中乙酸和EG作为主要副产物积累，可能竞争前体并抑制GA生产。为减少副产物形成，构建了缺失乙酸生成基因（ackA和pta）和EG合成基因（yqhD和fucO）的KPGA11。发酵结果显示，KPGA11的乙酸和EG产量显著降低，GA产量增至7.6 ± 0.4 g/L，表明竞争途径的消除有效提升了GA合成。

Optimization of culture conditions

为最大化GA产量，优化了KPGA11的培养条件。评估了pH（6.0、7.0、8.0）、转速（400、500、600 rpm）和通气率（0.5、1.0、1.5 vvm）的影响。最佳条件为pH 6.0、600 rpm、1.0 vvm，在此条件下GA产量达15.8 ± 0.6 g/L，比初始条件提高2.98倍。优化参数增强了细胞生长和代谢活性，促进了GA高效合成。

Fed-batch cultivation of the engineered strain

在优化条件下对KPGA11进行补料分批培养。GA滴度达70.1 ± 3.1 g/L，生产率为0.730 ± 0.033 g/L/h，转化率为0.283 ± 0.003 g/g。该性能代表了微生物系统利用碳源生产GA的最高报告产量，展示了工程菌株在工业化生产中的潜力。

Conclusion

我们使用木糖作为碳源，研究了肺炎克雷伯菌中通过Dahms途径生产GA的影响因素。初始重组菌株（KPGA0）高表达Dahms途径基因。第二重组菌株（KPGA1）缺失xylA基因，增加了木糖酸转化和GA的氧化通量。第三重组菌株（KPGA11）缺失另外四个基因（ackA、pta、yqhD和fucO），GA产量最高。通过优化培养参数和补料分批培养，GA产量进一步提升。本研究首次证明了通过上调肺炎克雷伯菌中木糖氧化途径实现高滴度GA生产，并报告了微生物系统利用碳源实现迄今最高GA产量。