Asrij/OCIAD1表达水平界定骨髓中功能迥异的造血干细胞亚群

本刊推荐：为解决造血干细胞（HSC）异质性难题，研究人员聚焦线粒体蛋白Asrij/OCIAD1，通过构建新型Asrij-mNeonGreen报告基因小鼠模型，揭示了Asrijlow HSCs具有更强的静息态和自我更新能力，而Asrijhigh HSCs则倾向于分化。该研究为在体内实时解析HSC命运决定提供了强大工具，对再生医学和血液疾病研究具有重要意义。

　　

在人体这座精密的生命大厦中，骨髓里的造血干细胞（Hematopoietic Stem Cells, HSCs）扮演着“生命之源”的角色，它们源源不断地分化产生各种血细胞，维系着机体的生命活动。然而，科学家们很早就发现，这群看似相同的干细胞其实是一个功能各异的“小社会”，有的干细胞擅长长期“待命”并自我复制（称为静息态），有的则更“活跃”，准备随时分化为特定血细胞。这种“异质性”使得HSC群体在面对压力、衰老或疾病时，反应各不相同。理解这种差异背后的调控机制，尤其是找到能区分不同功能HSC亚群的关键分子，对于在体外定向扩增所需的干细胞、或开发针对血液系统疾病的新疗法至关重要。

目前，已有一些研究利用报告基因小鼠模型，通过标记特定基因（如Hoxb5、Fgd5）的表达来窥探HSC的异质性，但调控HSC命运的完整网络仍未被完全揭示。近年来，一个名为Asrij（也称OCIAD1）的线粒体蛋白引起了研究人员的注意。先前的研究表明，Asrij对于维持HSC的静息状态、防止其过度增殖和衰老至关重要。一个特别有趣的现象是，在骨髓的HSC群体中，只有大约47%的细胞高表达Asrij，这强烈暗示着Asrij的表达水平本身可能就是HSC功能异质性的一个内在“分水岭”。为了验证这一假说，并创造出能够实时、活体研究Asrij⁺细胞命运的强大工具，来自印度尼赫鲁高级科学研究中心的研究团队开展了一项深入研究，其成果发表在《Experimental Hematology》上。

研究人员为开展本研究，主要应用了以下几项关键技术：利用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建了Asrij-mNeonGreen报告基因敲入小鼠模型，并通过PCR、免疫印迹等技术进行了验证；通过流式细胞术（FACS）分离了基于Asrij表达水平的不同HSC亚群（Asrij^low和Asrij^high）；采用了体外甲基纤维素集落形成实验、体外长期培养实验、竞争性归巢实验和造血干细胞移植实验等功能学分析方法；利用细胞周期染料（Hoechst 33342和Pyronin Y）以及线粒体膜电位探针（TMRM）进行细胞周期和代谢状态分析；并对分选的细胞进行了批量转录组测序（RNA-seq）和生物信息学分析。

生成和验证新型Asrij-mNeonGreen报告基因小鼠

研究团队首先成功利用CRISPR-Cas9技术，将mNeonGreen荧光蛋白标签敲入到小鼠Asrij基因的第4个外显子中，构建了Asrij-mNeonGreen（Asrij-mNG）报告基因小鼠。他们通过基因型鉴定、免疫印迹和流式细胞术等多种方法证实，该报告基因能准确反映内源性Asrij的表达，且杂合子小鼠（het-KI）的生理指标、血细胞计数和HSC频率均与野生型小鼠无差异，表明该模型可用于正常生理条件下的研究。

Asrij表达水平决定骨髓造血干细胞和祖细胞的功能异质性

利用该报告小鼠，研究人员发现骨髓中的造血干细胞和祖细胞（HSPCs，即Lin^-c-kit⁺Sca1⁺细胞）可根据Asrij表达水平分为Asrij^high（约60%）和Asrij^low（约30%）两个群体。功能实验表明，Asrij^high HSPCs在体外形成集落的能力更强，表明其分化倾向更高。细胞周期分析显示，Asrij^low HSPCs更多地处于静息的G0期，而Asrij^high细胞则富集于活跃的G1期。在体内，Asrij^low组细胞表现出更强的归巢到受体小鼠骨髓和脾脏的能力。移植实验进一步揭示，虽然两组细胞在外周血的重建能力上无显著差异，但Asrij^low HSPCs在受体骨髓的HSPC室和髓系细胞室中展现了更高的嵌合率，并且其细胞组成中富含长期造血干细胞（LT-HSCs），而短期重建造血祖细胞（MPP3/4）则减少。

Asrij表达水平区分骨髓中静息和活化的LT-HSCs

研究人员将目光聚焦于最原始的LT-HSCs群体，发现其内部的Asrij表达异质性最为显著，仅有45%是Asrij^high。有趣的是，在体外分化实验中，两个LT-HSCs亚群的集落形成能力没有差异，暗示Asrij水平主要影响更早期的干细胞状态而非终末分化命运。然而，在体外培养实验中，Asrij^high LT-HSCs培养后更多地分化为MPPs，而Asrij^low LT-HSCs则表现出更强的自我更新能力，能产生更多的LT-HSCs。细胞周期分析为这一功能差异提供了直接证据：高达88%的Asrij^low LT-HSCs处于G0期，而Asrij^high LT-HSCs则更多处于G1和S/G2/M期。这些结果表明，低水平的Asrij标记了一群处于深度静息、擅长自我更新的LT-HSCs，而高水平的Asrij则标志着细胞进入活化周期，准备分化。

Asrij^high LT-HSCs显示出活化的转录特征

为了从分子层面揭示差异，研究团队对分选的Asrij^low和Asrij^high LT-HSCs进行了转录组测序分析。结果显示，两组细胞的转录谱存在巨大差异，共有超过8000个基因表达不同。基因集富集分析（GSEA）表明，Asrij^high细胞中与细胞周期进程和氧化磷酸化（OXPHOS）相关的通路被显著激活，而与钙粘蛋白信号和干细胞多能性相关的通路则被抑制。具体而言，Asrij^high细胞中编码线粒体电子传递链（ETC）复合物的基因显著上调，糖酵解相关基因下调，并且其线粒体膜电位（MMP）更高，这些都指向其代谢状态从静息时的糖酵解转向了活化时的氧化磷酸化。更引人注目的是，Asrij^high细胞的基因表达特征与用LPS或poly(I:C)（pIC）免疫刺激剂处理后的HSCs活化特征高度相似，并且与已知的HSC活化基因签名有57%的重合。所有这些分子证据都一致地表明，高表达Asrij的LT-HSCs处于一种代谢和转录上活化的状态。

综上所述，本研究通过构建一个新颖的Asrij-mNeonGreen报告基因小鼠模型，有力地证明了线粒体蛋白Asrij的表达水平是界定骨髓造血干细胞功能异质性的一个关键内在标志。Asrij^low的HSCs代表了一个更为原始、处于静息状态、具有强大自我更新和长期重建能力的亚群；而Asrij^high的HSCs则代表了一个代谢活化、进入细胞周期、倾向于分化的亚群。该研究不仅将Asrij的地位从一个广泛的造血稳态维持者提升为一个定义HSC命运和身份的关键决定因子，而且其所提供的报告小鼠模型成为了一个强大的体内研究工具，为未来实时追踪HSC的命运、解析其异质性的分子基础、乃至探索在衰老或应激条件下HSC亚群的变化规律开辟了新的道路。