理性设计提升糖基转移酶UGT94E13热稳定性实现高效生物合成瑞鲍迪苷M8

本研究通过计算机辅助理性设计（PROSS与FireProt）、结构分析与进化保守性分析相结合的策略，成功改造糖基转移酶UGT94E13，获得热稳定性显著提升的突变体M5（Tm值提高5.4?°C，半衰期延长14.8倍），同时酶活提高1.08倍，克服了酶催化效率与热稳定性的“权衡效应”。该变体在级联催化系统中高效合成天然甜味剂Reb M8（产量达35.30?g/L），为食品工业中高性能甜味剂的绿色制造提供强稳健的 biocatalyst。

　　

Highlight

Strains, plasmids and reagents

本研究所用质粒编码的UGT94E13突变体M0来源于本实验室保存库。常规克隆操作使用大肠杆菌（Escherichia coli）TOP10作为宿主菌，而蛋白表达则采用E. coli BL21(DE3)。UGT94E13变体基因片段克隆至pET-21b(+)表达载体T7启动子下游。详细质粒来源见表S1。所有定点突变均通过重叠延伸PCR（overlap-extension polymerase chain reaction）引入。

Computer-aided rational design for enhanced thermostability

计算机辅助理性设计在酶工程中具有关键优势——它能够构建小而精准的突变库，最大限度保留酶的结构功能，有效克服单一方法的局限性。为提升UGT94E13的热稳定性以实现瑞鲍迪苷M8（Reb M8）的高效生物合成（图1A），我们首先采用蛋白质一站式修复平台PROSS（Protein Repair One-Stop Shop）和热稳定性预测工具FireProt，针对M0分别理性构建了包含40和51个突变体的两个文库。

Conclusion

总而言之，我们通过整合PROSS与FireProt的理性设计、进化保守性及结构分析，成功增强了UGT94E13的热稳定性，并保持其催化效率不变。该组合策略高效缩小了突变库规模，精准筛选出稳定突变。最终获得的四突变体M5（M0-T102D/V110I/F208Y/N251E）相较于M0，熔解温度（Tm）显著提高5.4?°C，酶活提升至108%，打破了酶学中常见的“活性-稳定性”权衡悖论。