针对股骨骨干及经过模拟热处理的牙齿，开发并评估了一种优化的古代DNA提取方法

《Forensic Science International: Genetics》：Development and Evaluation of an Optimized Ancient DNA Extraction Method for Femoral Diaphyses and Simulated Heat-treated Teeth

古DNA提取技术优化及在法医高度降解骨骼样本中的应用。通过调整裂解和纯化条件，开发出法医专用古DNA提取（FADE）方法，显著提升热处理牙齿和股骨中段样本的DNA浓度及STR分析成功率，为复杂法医鉴定提供新方案。

　　在法医学领域，DNA提取是人类身份鉴定的重要环节，尤其是在处理高度降解的硬组织样本时，如骨骼和牙齿。这类样本通常因环境因素、时间流逝或化学处理而造成DNA结构的严重破坏，使得传统提取方法难以有效获取足够的DNA用于后续分析。本文的研究旨在优化古代DNA（aDNA）提取技术，以开发一种专门适用于高度降解法医学样本的方法。

骨骼作为DNA保存的主要来源，其结构特点为DNA提供了一定程度的保护。然而，DNA的保存状态受到多种因素的影响，包括骨骼类型、组织结构、环境条件以及个体死亡时的年龄等。例如，不同骨骼的结构差异会导致DNA保存状态的不同，而环境中的温度、湿度、微生物活动、土壤酸碱度、埋藏深度以及辐射等因素也会加速DNA的降解过程。总体而言，DNA保存更倾向于在低温、干燥、中性至弱碱性pH值和较深埋藏的条件下更为理想。因此，在提取过程中，必须综合考虑这些因素，以确保提取的DNA质量和完整性。

在法医学实践中，骨骼样本常用于识别人类遗骸，尤其是在涉及恐怖袭击、有组织犯罪、大规模灾难或集体墓葬等场景中。然而，与新鲜组织或体液相比，从骨骼中提取DNA更具挑战性。这是因为骨骼中核细胞数量较少，DNA随时间逐渐降解，并且DNA通常与羟基磷灰石（骨的主要无机成分）紧密结合，这会阻碍聚合酶链式反应（PCR）扩增过程。此外，共提取的环境污染物，如腐殖酸和金属离子，以及微生物如细菌和真菌，也会干扰后续分析。因此，高效提取骨骼DNA不仅需要保留碎片化的DNA，还需要尽量减少共提取的PCR抑制剂。

目前，用于骨骼DNA提取的方法尚未被广泛认为是最优解。不同实验室在提取过程中可能采用不同的裂解液配方、裂解液与骨粉的比例、裂解时间、裂解温度等参数。根据不同的纯化方式，提取方法可以分为有机法、磁珠法和离心柱法。然而，关于哪种纯化方法最适用于骨骼DNA提取尚无明确共识。有机法通常使用苯酚、氯仿和异丙醇等有机溶剂进行DNA分离和纯化，虽然其提取的DNA浓度较高，但一些研究认为这种高浓度可能是由于使用了更多的骨粉。此外，有机法还存在一些缺点，如DNA产物中残留有机物质和使用有毒有机试剂的问题。磁珠法则利用磁性粒子结合DNA的特性，分离DNA，这种方法可以有效减少抑制剂的共提取，且适用于半自动和全自动提取过程。离心柱法则是利用硅胶膜在高盐和低pH条件下结合DNA，低盐和高pH条件下释放DNA。尽管这种方法操作相对简单且成本适中，但其需要多次更换离心管，增加了污染风险，并且难以实现高通量自动化。因此，尽管离心柱法在实际应用中较为普遍，但在某些情况下仍存在局限性。

近年来，aDNA提取方法在法医学领域的应用逐渐增多。这些方法在处理高度降解样本方面表现出色，能够有效分离和纯化短DNA片段，适用于骨骼遗骸和沉积物等古老的材料。然而，这些方法通常针对短DNA片段（约50 bp）的提取，而法医学实践中常用的短串联重复（STR）分析则依赖于较长的DNA片段（通常超过100 bp）。因此，直接将aDNA提取方法应用于法医学案件可能无法达到最佳效果。为了克服这一问题，本文研究团队对aDNA提取流程进行了系统优化，以提高其在法医学样本中的适用性和有效性。

研究团队通过结合真实案例样本和模拟样本，对提取过程中的关键步骤进行了系统的优化。他们对裂解温度、裂解时间、裂解液配方、纯化方法等参数进行了比较和调整，以确保提取方法在实际应用中的可行性。例如，在裂解温度的比较实验中，团队对基于离心柱和磁珠的两种aDNA提取方法分别在37°C和56°C的温度条件下进行了测试，结果显示较高的裂解温度有助于提高DNA提取效率。此外，团队还对不同降解程度的样本进行了测试，验证了优化后的提取方法在不同条件下的表现。

优化后的提取方法被称为法医学aDNA提取（FADE）方法，其在处理高度降解的股骨样本和模拟高温处理的牙齿样本时表现出显著优势。实验结果显示，FADE方法在处理经过长时间高温处理的样本时，能够显著提高DNA峰高，并在不同处理组中分别实现30%和45%的提升。此外，该方法还能获得更多的扩增位点和等位基因，这表明其在提取DNA质量和完整性方面具有更高的效率。这些结果进一步证明了FADE方法在处理高度降解法医学样本方面的有效性。

FADE方法的成功不仅在于其对DNA提取的优化，还在于其在实际应用中的验证。通过系统地调整和测试提取过程中的各个关键步骤，团队确保了该方法在复杂法医学场景中的适用性。此外，团队还测试了该方法在不同降解程度样本中的表现，评估了其在DNA产量和STR分型成功率方面的提升。这些实验结果表明，FADE方法能够有效提高DNA提取的成功率，为法医学领域的复杂样本分析提供了一种可靠的解决方案。

综上所述，FADE方法的开发和优化为处理高度降解法医学样本提供了新的技术路径。通过结合aDNA提取技术的优势，并对其进行适应性调整，该方法不仅能够提高DNA提取的效率，还能确保DNA质量的完整性，从而提高STR分型的成功率。在实际应用中，FADE方法可以显著增强人类遗骸鉴定的成功率，提高法医学分析的可靠性与准确性。未来，随着技术的不断进步和应用的不断拓展，类似的方法有望在更多复杂的法医学案例中发挥重要作用。