独脚金内酯通过DNA去甲基化诱导苯丙烷生物合成增强番茄盐胁迫抗性的机制研究

本研究针对番茄盐胁迫导致的生长抑制问题，通过外源施加独脚金内酯类似物GR24，系统揭示了SLs介导的DNA去甲基化通过调控苯丙氨酸代谢和苯丙烷生物合成途径增强耐盐性的新机制。研究发现GR24处理使叶片数、根表面积和根体积分别增加26.67%、55.76%和55.81%，并通过降低SlPAL5、SlHDC等关键基因的甲基化水平，激活苯丙烷代谢通路，促进酚类物质积累，为作物抗逆育种提供了新策略。

　　

在全球气候变化和土壤盐渍化日益严重的背景下，农作物生产面临着前所未有的挑战。番茄(Solanum lycopersicum L.)作为世界上最重要的园艺作物之一，其生长和发育极易受到盐胁迫的负面影响。盐胁迫不仅破坏离子稳态，导致渗透和激素失衡，还会诱发活性氧(ROS)大量产生，造成氧化损伤，最终显著降低作物产量和品质，威胁粮食安全。传统的抗盐育种方法进展缓慢，迫切需要探索新的提高作物耐盐性的途径。

植物激素在调控植物应对非生物胁迫中发挥着关键作用。独脚金内酯(strigolactones, SLs)作为一种新型植物激素，最初在棉花根部分泌物中发现，近年来被证明不仅参与植物生长发育调控，还在应对逆境胁迫中具有重要功能。GR24作为SLs的合成类似物，因其无毒、易降解和高效的特性，被广泛用于增强作物抗逆性研究。然而，关于外源SLs如何通过表观遗传调控增强番茄耐盐性的具体分子机制，特别是与DNA甲基化的相互作用关系，尚不明确。

发表在《Horticultural Plant Journal》上的这项研究，通过综合运用转录组测序(RNA-seq)、全基因组亚硫酸氢盐测序(WGBS)、甲基化特异性PCR(MSP)等关键技术方法，以番茄品种"Micro-Tom"四叶期幼苗为实验材料，设置了NaCl(150 mmol·L^-1)、NaCl+GR24(15 μmol·L^-1)、NaCl+Tis108(SLs生物合成抑制剂，3 μmol·L^-1)、NaCl+5-azaC(DNA甲基化抑制剂，50 μmol·L^-1)等多组处理，深入探究了SLs介导的DNA去甲基化在番茄盐胁迫响应中的作用机制。

3.1. GR24和5-氮杂胞苷能够缓解盐胁迫对番茄幼苗的损伤

研究发现，盐胁迫显著抑制了番茄幼苗的叶片数、根表面积和根体积，而外源施加GR24处理后，这些形态指标分别增加了26.67%、55.76%和55.81%。SLs生物合成抑制剂Tis108逆转了这种积极效应。值得注意的是，5-azaC单独处理提高了叶片数但降低了根表面积和根体积，而GR24与5-azaC联合处理则显著促进了所有生长指标，表明GR24可能通过调节DNA去甲基化来缓解NaCl诱导的番茄幼苗抑制。

3.2. 盐胁迫下外源GR24处理的番茄幼苗叶片的RNA-seq和WGBS分析

转录组分析显示，与NaCl处理相比，NaCl+GR24处理组有1367个基因上调表达，277个基因下调表达。全基因组甲基化分析表明，GR24在盐胁迫下降低了DNA甲基化水平，其中CHG背景的甲基化变化最为显著。关联分析发现，虽然全基因组范围内发生了大量甲基化变化，但GR24引起的DNA甲基化影响了特定基因的转录水平，且DNA去甲基化倾向于促进基因表达。

3.3. 苯丙氨酸代谢和苯丙烷生物合成通路被GR24介导的DNA甲基化激活

KEGG富集分析显示，"苯丙氨酸代谢"和"苯丙烷生物合成"通路在差异表达基因(DEGs)和差异甲基化基因(DMGs)中显著富集。热图分析表明，GR24处理后，苯丙氨酸代谢和苯丙烷生物合成通路中的关键基因呈现上调趋势，表明GR24介导的DNA去甲基化可能通过激活这些代谢通路来缓解盐胁迫。

3.4. GR24介导DNA去甲基化激活苯丙氨酸代谢和苯丙烷生物合成通路的生物信息学模型

STRING数据库分析揭示，GR24处理后，PAL、PAL5、HDC、CYP98A3和BGLU41等基因发生去甲基化，并作为关键基因通过与该通路中其他基因结合启动信号转导，可能通过直接或间接相互作用调节下游基因表达。

3.5. GR24介导的去甲基化调节L-苯丙氨酸、苯乙胺、肉桂酸、香豆素、咖啡酸和木质素含量

代谢物含量测定结果显示，盐胁迫下L-苯丙氨酸(LPA)和肉桂酸(CA)含量增加，而苯乙胺(PEA)、香豆素、咖啡酸和木质素含量降低。GR24处理逆转了这种趋势，促进了LPA和CA的代谢以及PEA、香豆素、咖啡酸和木质素的生物合成。GR24与5-azaC联合处理进一步强化了这种效应，为SLs介导的DNA去甲基化通过促进苯丙氨酸代谢和苯丙烷生物合成通路激活来缓解盐胁迫提供了证据。

3.6. GR24和5-氮杂胞苷对盐胁迫下L-苯丙氨酸解氨酶、苯丙氨酸脱羧酶、5-O-(4-香豆酰)-D-奎宁酸3'-单加氧酶和β-葡萄糖苷酶活性的影响

酶活性分析表明，盐胁迫抑制了PAL、HDC、CYP98A3和BGLU的活性，而GR24处理显著提高了这些酶的活性。Tis108处理则显著降低了这些酶活性。5-azaC单独处理也促进了这些酶活性，而GR24与5-azaC联合处理表现出协同增效作用，证明SLs可以通过降低DNA甲基化水平来增强酶活性和苯丙烷类化合物含量。

3.7. 苯丙氨酸代谢和苯丙烷生物合成通路相关基因的qRT-PCR分析

基因表达分析显示，盐胁迫下SlPAL5、SlHDC、SlBGLU41、SlCYP98A3、SlCYP73A4和Sl4CLL7基因表达显著下调，而GR24处理显著促进了这些基因的表达。5-azaC处理也提高了这些基因的表达水平，且GR24与5-azaC联合处理表现出协同效应，证实SLs参与DNA去甲基化过程，激活了苯丙氨酸代谢和苯丙烷生物合成相关基因的表达。

3.8. 不同处理下番茄幼苗叶片中PAL5、HDC、BGLU41和CYP98A3的甲基化特异性PCR分析

MSP分析结果显示，盐胁迫加剧了苯丙氨酸代谢和苯丙烷生物合成通路相关基因的甲基化程度，而GR24处理缓解了盐胁迫引起的甲基化。NaCl+GR24、NaCl+5-azaC和NaCl+GR24+5-azaC处理均显示出明显的去甲基化条带，表明较低的甲基化水平。这些结果初步验证了RNA-seq和WGBS分析的假设，即外源SLs可能通过介导苯丙氨酸代谢和苯丙烷生物合成通路关键基因的DNA去甲基化来缓解番茄幼苗的盐胁迫。

3.9. GR24介导的苯丙氨酸代谢和苯丙烷生物合成相关基因去甲基化促进其在盐胁迫响应中的表达

综合研究结果表明，SlCYP98A3启动子区CG位点、SlBGLU41基因体区CG位点、SlPAL5基因体区CHG位点、SlPAL启动子区CHG位点和SlHDC启动子区CHG位点的去甲基化可能导致了这些基因的转录，激活了其他基因如SlCYP73A4和Sl4CLL7的表达，从而增强PAL、HDC、CYP98A3和BGLU活性，促进LPA、PEA、肉桂酸、香豆素、咖啡酸和木质素的代谢。

本研究系统揭示了外源SLs通过介导DNA去甲基化增强番茄耐盐性的新机制。研究发现，GR24处理通过降低SlPAL5、SlHDC、SlBGLU41、SlCYP98A3等关键基因的甲基化水平，激活苯丙氨酸代谢和苯丙烷生物合成通路，促进酚类物质的积累，从而提高番茄的盐胁迫抗性。这些发现不仅深化了对SLs信号传导与DNA甲基化交叉对话的理解，而且为利用表观遗传调控手段提高作物抗逆性提供了新思路。研究的创新性在于首次将SLs信号、DNA去甲基化和苯丙烷代谢通路联系起来，构建了一个完整的盐胁迫响应调控网络。该研究结果对于开发新型作物抗逆剂、培育耐盐作物品种具有重要的理论和实践意义，为解决全球盐渍化问题提供了有前景的策略。未来的研究可以进一步探索SLs介导的DNA去甲基化是否还通过其他途径实现对非生物胁迫的响应，以及不同植物激素在这一过程中的相互作用机制。