通过酶级联反应及原位辅因子再生技术，将农业工业生物质糖蜜转化为D-甘露醇

《Industrial Crops and Products》：Upcycling agro-industrial biomass molasses into D-mannitol via an enzymatic cascade with in situ cofactor regeneration

高效酶级联反应从糖蜜中直接生产甘露醇及副产物D-葡萄糖内酯。采用invertase水解蔗糖生成等摩尔葡萄糖和果糖，通过GDH和MDH的协同作用，葡萄糖氧化再生NADH，同时果糖还原生成甘露醇。两步法（蔗糖水解后分步反应）和一步法（所有酶同步作用）均实现高转化率（92%-95%），且无需糖蜜预处理。酶活性在复杂基质中保持稳定，补充葡萄糖可完全消耗残留果糖。该系统为农业废弃物高值化利用提供可持续解决方案，符合循环经济与绿色生物制造理念。

　　本研究探讨了一种高效的酶促级联反应系统，将糖蜜直接转化为具有广泛应用价值的山梨醇。糖蜜是糖精炼过程中的副产品，富含蔗糖、D-葡萄糖和D-果糖，但其在高附加值生物制造中的利用率仍然较低。通过整合三种关键酶：蔗糖酶（invertase）、山梨醇脱氢酶（MDH）和葡萄糖脱氢酶（GDH），该系统实现了从糖蜜中高效生产山梨醇，并同时生成高附加值的D-葡萄糖酸内酯。这一策略不仅提升了资源利用率，还符合循环经济和绿色生物加工的理念，为农业工业废弃物的资源化利用提供了新的思路。

在本研究中，我们评估了两种反应格式：一种是分步反应系统，通过优化每种酶的特定条件，依次进行蔗糖水解和D-果糖还原；另一种是一锅法反应系统，使得整个过程更加简便，减少了操作步骤，提高了工业应用的可行性。结果显示，分步系统在24小时内能够实现约92%的山梨醇转化率，而一锅法的转化率则达到了约95%。值得注意的是，糖蜜预处理并不是生产山梨醇的必要步骤，这表明该反应系统能够在复杂糖蜜基质中保持高催化活性，同时通过补充葡萄糖来促进辅因子再生，从而完全消耗D-果糖，避免了残留问题。

本研究的核心在于构建一个自给自足的红ox循环系统，以解决传统微生物发酵过程中常见的副产物生成问题。微生物发酵虽然能够生产山梨醇，但由于D-果糖既是底物又是微生物生长所需的碳源和能量来源，导致部分D-果糖被消耗用于细胞生长，影响了山梨醇的完全转化。此外，微生物代谢还可能生成乳酸、乙酸、乙醇等副产物，进一步降低了产物选择性和增加了下游纯化的难度。相比之下，酶促级联反应系统能够将所有D-果糖引导至山梨醇的合成路径，从而实现接近100%的转化效率。同时，由于没有活细胞参与，系统不会产生有机酸、乙醇等副产物，简化了产物回收过程。

在实际应用中，我们选择了来源于荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）的MDH和来源于枯草芽孢杆菌（Bacillus megaterium）的GDH，并通过重组大肠杆菌（E. coli）表达和纯化这些酶。为了确保实验的可靠性，我们对糖蜜进行了预处理，以去除可能干扰后续分析的杂质。通过Carrez澄清法，我们成功地去除了糖蜜中的沉淀物和蛋白质，同时保持了主要糖分的完整性。结果显示，糖蜜中D-葡萄糖和D-果糖的比例在预处理前后基本保持不变，且糖分回收率高达97%，这表明预处理对糖分的干扰极小。

在酶促级联反应的优化过程中，我们系统地评估了不同酶比例对反应效率的影响。MDH和GDH在反应中通过共享辅因子NADH/ NAD+进行耦合，其中GDH负责D-葡萄糖的氧化以再生NADH，而MDH则催化D-果糖还原为山梨醇。由于MDH对D-果糖的亲和力较低，导致其在反应中成为速率限制因素。通过调整GDH与MDH的比例，我们发现当GDH与MDH的比例为1:2时，山梨醇的生成速率显著提高。进一步优化表明，当比例达到1:6时，反应效率达到最佳状态，而更高的比例并未带来显著提升，说明酶的使用量在一定程度上受到反应动力学和热力学的限制。

在实际糖蜜转化过程中，我们观察到在分步反应中，蔗糖被高效水解为D-葡萄糖和D-果糖，随后通过MDH和GDH的协同作用，将D-果糖转化为山梨醇。一锅法反应则在相同的条件下，通过同时进行蔗糖水解、D-果糖还原和D-葡萄糖氧化，实现了更高效的转化。然而，两种方法在反应过程中均检测到一定量的D-果糖残留，这可能与糖蜜中D-葡萄糖和D-果糖的初始比例失衡有关。通过补充额外的D-葡萄糖，我们成功地消除了D-果糖残留，提高了山梨醇的产率。这表明，在实际应用中，调整底物比例对于提高反应效率具有重要意义。

此外，本研究还探讨了不同反应条件对酶活性的影响。我们发现，invertase在pH 4.5条件下表现出最佳活性，而GDH和MDH则在中性pH（约7.0）下具有更高的催化效率。由于invertase和GDH/MDH的最适pH条件存在差异，我们分别采用了分步和一锅法反应策略。分步反应能够通过优化每一步的条件，提高整体转化效率，而一锅法则在操作简便性方面具有优势，更适合工业化生产。在实际反应过程中，我们还发现invertase在非最佳pH条件下仍能保持较高的活性，这使得一锅法成为一种可行的替代方案。

为了验证该酶促级联反应系统的有效性，我们对反应过程进行了详细的分析。在分步反应中，蔗糖被完全水解为D-葡萄糖和D-果糖，随后在第二步中，MDH和GDH协同作用，将D-果糖转化为山梨醇。一锅法反应则在相同条件下，通过同步进行所有反应步骤，实现了更高的山梨醇产率。HPLC分析结果显示，两种方法均能够实现超过90%的转化率，表明该系统在实际应用中具有很高的可行性。

从经济和环境角度来看，该研究提供了一种可持续的解决方案，将高价值产品从低成本的工业废弃物中提取出来。通过酶促反应，我们不仅能够高效地生产山梨醇，还能同时生成D-葡萄糖酸内酯，这为糖蜜的资源化利用提供了额外的经济价值。此外，该方法不需要复杂的营养补充或废物处理，减少了对环境的影响，符合绿色生物加工和循环经济的理念。

在实际应用中，尽管大肠杆菌能够高效表达和纯化所需的酶，但其不被视为食品级安全菌株（GRAS）。因此，如果该系统要用于食品或制药行业，可能需要进一步探索在GRAS认证的微生物宿主中表达这些酶的可行性。此外，糖蜜的高粘度特性可能会影响酶促反应的效率，因此在高浓度条件下，可能需要进行适当的预处理以提高反应速率和产率。未来的研究应关注如何在保持高转化效率的同时，优化反应条件以提高经济可行性。

综上所述，本研究提出了一种创新的酶促级联反应系统，能够将糖蜜转化为高价值的山梨醇，同时生成D-葡萄糖酸内酯作为副产品。该系统在分步和一锅法两种策略中均表现出优异的性能，为农业工业废弃物的资源化利用提供了新的途径。通过合理调整酶比例和反应条件，我们能够实现高效的山梨醇生产，同时减少对环境的影响。未来的研究应进一步优化该系统，探索其在更高浓度糖蜜中的应用，并评估在GRAS认证微生物宿主中表达酶的可行性，以推动该技术在工业和商业领域的广泛应用。