靶向敲除SmCPS4基因可提高丹参（Salvia miltiorrhiza）中丹参酮（tanshinone）的产量

《Industrial Crops and Products》：Targeted knockout of SmCPS4 elevates tanshinone production in Salvia miltiorrhiza

本研究利用CRISPR/Cas9技术靶向编辑紫草中的SmCPS4基因，显著提高了檀香酮及其衍生物的积累量，并揭示了转录因子SmMYB1/9b和SmWRKY1/2的上调对代谢重编程的调控作用。

　　在植物生物技术和药物开发领域，Salvia miltiorrhiza（丹参）作为一种重要的药用植物，因其富含多种具有生物活性的化合物而备受关注。其中，丹参酮（tanshinones）是一类从丹参根部和根茎中提取的高氧化度二萜类天然产物，具有广泛的药理活性，包括扩张血管、抗心律失常等特性。丹参酮不仅是传统中药的重要成分，还在现代药物研发中展现出潜在的抗癌作用，其机制涉及诱导细胞凋亡、抑制肿瘤增殖以及增强化疗和放疗的敏感性。随着对丹参酮生物合成途径研究的深入，科学家们逐渐认识到，通过基因编辑技术调控相关基因表达，是提升丹参酮产量和优化其药用价值的关键策略。

为了实现这一目标，研究团队采用了一种基于Agrobacterium的基因编辑技术，结合了经过优化的丹参原生质体基因编辑元件，成功构建了一个高效、可控的基因编辑平台。该平台不仅能够实现对目标基因的精准编辑，还能有效提高编辑效率，从而推动丹参酮的生物合成过程。在本研究中，SmCPS4被选为一个关键基因进行编辑，因为该基因参与了丹参酮生物合成中的一个竞争分支，其表达水平可能影响丹参酮的积累模式。通过精准编辑SmCPS4，研究人员发现，丹参酮的总含量显著增加，达到了4.09?mg/g干重，是对照组的1.42倍。同时，该基因的敲除还促进了四种主要丹参酮（CPT、Tan I、Tan IIA和DHT）的积累，其中CPT的含量增加了1.53倍，DHT增加了1.59倍，显示出该基因在丹参酮生物合成中的重要作用。

在实验方法上，研究团队首先通过原生质体筛选优化了基因编辑元件，随后利用Agrobacterium介导的转化技术，对丹参的SmPDS基因进行了高效的基因编辑，达到了69.4%的编辑效率。这种高效的编辑策略不仅适用于SmPDS，也为后续SmCPS4的编辑奠定了基础。为了验证基因编辑的效果，研究人员通过Sanger测序技术对目标基因的编辑类型进行了分析，结果显示，编辑后的植株中存在不同比例的异质性突变、同质性突变和嵌合突变，这些结果为理解丹参酮生物合成调控机制提供了重要的数据支持。

此外，研究团队还对丹参的转录调控网络进行了深入分析，发现SmCPS4的敲除不仅影响了丹参酮的积累，还导致了一系列与代谢相关基因的表达上调，包括SmHMGS、SmGGPPS、SmCYP76AH3和SmCYP71D373/375等。这些基因的表达变化表明，SmCPS4的抑制可能通过缓解代谢通量限制，激活补偿性转录调控网络，从而促进丹参酮的合成。进一步的转录因子分析显示，多个关键的转录因子，如SmMYB1/9b、SmbHLH10/37、SmERF115、SmWRKY1/2、SmGRAS1/3和SmSPL7，在SmCPS4敲除后显著上调，这表明它们在丹参酮合成过程中扮演了重要角色。

在实验设计方面，研究团队采用了多种技术手段，包括双荧光素酶报告系统（Dual-Luciferase Reporter Assay）和β-葡萄糖醛酸苷酶（GUS）报告系统，用于验证SmU6.1启动子的活性以及基因编辑的效果。这些实验不仅帮助研究人员确定了最佳的启动子长度（800 bp），还为后续的基因编辑提供了可靠的实验依据。此外，团队还利用高通量测序技术（RNA-seq）对丹参酮生物合成相关基因的表达模式进行了全面分析，发现这些基因在不同组织中的表达水平存在显著差异，其中根部的表达水平普遍高于其他组织。

通过这些实验，研究人员不仅揭示了SmCPS4在丹参酮生物合成中的关键作用，还为优化丹参的药用成分提供了新的思路和方法。研究结果表明，SmCPS4的抑制能够有效促进丹参酮的积累，同时激活一系列与代谢调控相关的基因，形成一个协同的调控网络。这种调控机制为未来通过基因编辑技术改良丹参品种、提高其丹参酮含量提供了重要的理论基础和技术支持。

在实际应用方面，这项研究的意义不仅限于基础科学，还具有重要的农业和制药价值。通过精准调控丹参酮的合成途径，可以培育出高丹参酮含量的丹参品种，从而满足日益增长的药用需求。此外，该研究也为其他药用植物的基因编辑提供了可借鉴的策略，推动了植物生物技术在药物开发中的应用。研究团队还指出，虽然目前的编辑效率已经取得显著进展，但仍需进一步优化，以提高同质性突变的比例，从而获得更稳定的转基因植株。

综上所述，这项研究通过基因编辑技术，成功揭示了SmCPS4在丹参酮生物合成中的关键作用，并为提高丹参酮含量提供了可行的策略。这些成果不仅有助于深入理解丹参酮的生物合成机制，还为药用植物的代谢工程提供了新的方向，推动了中药现代化和生物制药的发展。未来的研究可以进一步探索丹参酮合成中的其他关键基因，以及它们在不同环境条件下的表达调控机制，以实现更高效、更精准的药用植物改良。