基于癌症相关成纤维细胞标志基因的单细胞与批量RNA测序整合分析构建肺腺癌预后与治疗反应预测模型

本研究通过整合单细胞与批量RNA测序数据，鉴定出227个癌症相关成纤维细胞（CAF）标志基因，并构建基于DCN、POSTN和GPX8的3基因预后特征模型（CAFMGS）。该模型能有效区分肺腺癌（LUAD）患者的高风险与低风险组，高风险组表现为免疫抑制但对化疗药物敏感性更高，低风险组则显示更好的免疫治疗响应。研究为LUAD的个性化治疗提供了新的生物标志物和靶向策略。

　　

材料与方法

研究从GEO数据库获取单细胞转录组数据GSE123902，包含3例肺腺癌（LUAD）原发肿瘤和3例正常肺组织样本。批量转录组数据来自TCGA数据库，包含539例LUAD患者和59例正常样本，其中490例具有完整生存数据的患者用于模型构建。外部验证队列GSE31210包含226例LUAD样本。所有数据均符合伦理审查要求。

单细胞数据分析采用Seurat和SingleR软件包，通过严格质控筛选后，使用LogNormalize方法进行数据标准化，基于高变基因进行主成分分析（PCA）和t-SNE降维聚类。CAF标志基因的筛选标准为调整后P<0.05且|log2[折叠变化（FC）]|>1。

预后模型的构建首先通过limma包筛选肿瘤与正常组织间的差异表达基因（DEGs），再通过单变量Cox回归分析识别与总生存期（OS）相关的基因。采用LASSO Cox回归和逐步多变量Cox回归优化基因选择，最终建立基于3个基因的风险评分模型：风险评分=（?0.393 × DCN表达）+（0.236 × POSTN表达）+（0.179 × GPX8表达）。患者按中位风险评分分为高风险和低风险组。

结果

单细胞测序揭示CAF标志基因谱

分析共纳入14,863个细胞，鉴定出19个细胞簇，其中簇11被注释为成纤维细胞。LUAD组织中成纤维细胞数量显著高于正常组织。进一步聚焦肿瘤样本重聚类后，鉴定出簇9和簇19为癌症相关成纤维细胞（CAFs），共获得227个CAF标志基因。

CAF标志基因预后特征的构建与验证

从CAF标志基因中筛选出67个DEGs（33个上调，34个下调）。通过Cox回归分析识别出30个预后相关基因，经LASSO回归优化为11个基因，最终通过多变量分析确定3个核心基因（DCN、POSTN、GPX8）。风险模型在TCGA训练队列中显示高风险组OS显著较差（P<0.001），1年、3年和5年AUC分别为0.709、0.667和0.640。在测试队列和GEO验证队列中均得到一致验证（P=0.019和P=0.020），表明模型具有稳健的预测能力。

独立预后与列线图建立

单变量和多变量Cox回归证实风险评分是独立预后因素（P<0.05）。结合临床参数构建的列线图显示风险评分是最强预测因子，一致性指数（C-index）为0.813，校准曲线显示1年、3年和5年预测与实际生存高度一致。亚组分析证实模型在所有临床分期中均具有预测效力。

基因集富集分析

GSEA分析显示高风险组富集于细胞周期、DNA复制、同源重组等增殖相关通路；低风险组富集于B细胞受体、T细胞受体、VEGF信号通路等免疫相关通路，提示两组免疫微环境存在显著差异。

肿瘤免疫微环境与免疫相关基因

低风险组具有更高的基质评分、免疫评分和ESTIMATE评分（P<0.001）。免疫细胞浸润分析显示高风险组中初始B细胞、CD4记忆T细胞、活化NK细胞和M0-M1巨噬细胞增多，而低风险组中记忆B细胞、单核细胞和静息树突细胞增多。免疫检查点基因表达分析显示高风险组中CD274（PD-L1）、CD276、LAG-3等表达上调，低风险组中CD27、CD47、BTLA等表达升高。TIDE评分显示低风险组具有更低的免疫逃避倾向，且HLA家族基因全面上调，提示其更可能从免疫治疗中获益。

药物敏感性预测

GDSC平台分析显示高风险组对多西他赛、顺铂、长春瑞滨、帕妥珠单抗、阿法替尼、厄洛替尼、吉非替尼、拉帕替尼和奥希替尼等9种一线化疗药物敏感性更高（IC50更低），为临床用药选择提供了参考。

标志基因的差异表达验证

TCGA数据分析显示DCN在LUAD组织中表达下调（P<0.001），而POSTN和GPX8表达上调（P<0.001）。qRT-PCR实验进一步验证了这一结果：与10例正常肺组织相比，10例LUAD组织中DCN表达显著降低（P<0.05），POSTN和GPX8表达显著升高（P<0.05）。HPA数据库蛋白质水平检测同样证实了DCN下调、POSTN和GPX8上调的表达模式。

讨论

研究通过整合单细胞和批量转录组数据，首次构建了基于CAF标志基因的LUAD预后模型（CAFMGS）。DCN作为抑癌基因，通过调控ECM和诱导凋亡抑制肿瘤进展；POSTN作为促癌因子，通过整合素信号通路促进肿瘤侵袭和转移；GPX8作为新型氧化还原调控因子，与CAF浸润和肿瘤迁移密切相关。模型不仅能准确预测预后，还能区分免疫治疗和化疗的响应群体，低风险组显示更强的免疫细胞浸润和免疫治疗潜力，高风险组则对传统化疗更敏感。研究的局限性在于数据来源于回顾性队列，且未深入探讨机制。未来需通过实验验证基因功能及其在TME中的相互作用。

该研究为LUAD的精准治疗提供了新的生物标志物和靶点，强调了基质细胞在肿瘤微环境中的关键作用，为开发CAF靶向治疗策略奠定了理论基础。