棉花MAPK基因家族全基因组鉴定揭示GhMPK10通过蛋白激酶信号级联调控非生物胁迫耐受性的新机制

本研究针对棉花MAPK基因家族功能未明确、限制其抗逆性改良的问题，通过全基因组鉴定和系统分析，发现GhMPK10在干旱和盐胁迫下持续诱导表达。利用拟南芥过表达和棉花VIGS技术验证了GhMPK10通过调控MAPK信号通路（包括ABA应答气孔关闭基因和乙烯生物合成调控因子）增强抗逆性的关键作用，为培育抗逆棉花品种提供了重要分子靶点。

　　

随着全球气候变化加剧，干旱、盐碱和高温等非生物胁迫对农作物生产的威胁日益严重。棉花作为世界上最重要的经济作物之一，其生长和纤维产量受到非生物胁迫的显著影响。植物在长期进化过程中形成了复杂的信号转导网络来应对环境胁迫，其中丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-Activated Protein Kinase, MAPK）级联通路是真核生物中高度保守的信号转导机制，在环境信号传递和胁迫适应中起着至关重要的作用。然而，尽管MAPK基因家族在拟南芥、水稻等模式植物中得到了广泛研究，但在棉花中的系统鉴定和功能分析仍不完善，这严重限制了利用该基因家族改良棉花抗逆性的育种进程。

目前研究已知MAPK通路通常由三级激酶级联组成：MAPK激酶激酶（MAPKKK）接受上游信号后磷酸化激活MAPK激酶（MAPKK），进而激活MAPK。激活的MAPK通过磷酸化下游底物（如转录因子、酶等）来调控基因表达、代谢活动、细胞分裂和应激反应等生物学过程。植物MAPK基因根据蛋白序列和磷酸化位点特征可分为A、B、C、D四个组，其中A、B、C组成员具有TEY（Thr-Glu-Tyr）激活 motif，而D组成员则具有TDY（Thr-Asp-Tyr）motif和较长的C端序列。

在棉花中，虽然已有研究报道了55个MAPK基因的存在，但大多数成员的功能尚未明确，特别是在非生物胁迫响应中的具体调控机制知之甚少。解析棉花MAPK基因家族的完整组成和功能，对于理解棉花胁迫信号响应机制和培育抗逆品种具有重要理论价值和实践意义。

为了解决这一问题，研究人员在《BMC Plant Biology》上发表了最新研究成果，通过对棉花MAPK基因家族进行全基因组鉴定和系统分析，发现了一个关键基因GhMPK10，并深入解析了其在调控非生物胁迫耐受性中的分子机制。

研究人员采用了多种技术方法开展本研究：首先通过同源搜索和结构域分析从棉花基因组中鉴定出56个GhMPK基因；利用生物信息学方法分析这些基因的系统发育关系、染色体定位、基因结构和保守 motif；采用转录组测序技术分析基因在不同组织和胁迫条件下的表达模式；通过拟南芥过表达和病毒诱导基因沉默（VIGS）技术进行功能验证；使用RNA-seq技术对沉默植株进行转录组分析；通过蛋白互作网络预测GhMPK10的相互作用基因。

研究结果首先揭示了GhMPK基因家族的基本特征。基因组鉴定与系统发育分析显示，56个GhMPK基因被分为A、B、C、D四个进化组，其中D组包含21个成员，是最大的组。这些基因不均匀分布在24条染色体上，每个染色体上的基因数量从1到5个不等。基因结构分析发现，同一组的成员具有相似的外显子-内含子结构，A组和B组成员通常含有5-6个外显子，C组成员仅含有1个内含子和2个外显子，而D组成员则具有更复杂的结构，内含子数量达到8-12个。

保守结构域分析表明，所有GhMPK蛋白都包含11个激酶结构域，其中结构域VII和VIII在植物中高度保守。A、B、C组成员具有TEY激活域（除GhMPK26和GhMPK22含有TEC域外），而D组成员则具有TDY激活域（除GhMPK46含有TDC域外）。此外，A组和B组成员在C端含有保守的停靠（CD）结构域，序列为(LH)DxxDE(p)xC，这一结构域作为MAPK磷酸酶、MAPKK和底物的结合位点。

组织特异性表达分析显示，大多数GhMPK基因在棉花各个组织中均有表达，但表达水平存在差异。GhMPK20、GhMPK21、GhMPK46和GhMPK55在所有测试组织中的表达水平都很低，而GhMPK44和GhMPK19（D组）在几乎所有组织中都有表达，尤其在雄蕊和胚珠中表达最高。GhMPK1和GhMPK5（A组）在花托中高表达，而在雌蕊中表达较低。

非生物胁迫表达谱分析发现，30个GhMPK基因在冷、热、盐和干旱胁迫条件下高表达。大多数GhMPK基因被所有胁迫条件诱导，表明它们在胁迫响应中起着重要作用。特别值得注意的是，GhMPK10、GhMPK17和GhMPK27在所有胁迫条件下都表现出高而稳定的表达，提示它们可能在棉花非生物胁迫响应中发挥核心调控作用。

研究人员选择GhMPK10进行深入的功能验证。RT-qPCR分析显示，GhMPK10在根、茎、花和雌蕊中表达显著升高，在苞片和雄蕊中表达中等，在叶片中表达相对较低。在干旱和盐胁迫下，GhMPK10在棉花幼苗中迅速且持续地被诱导表达。

为了验证GhMPK10的功能，研究人员构建了GhMPK10过表达载体并将其转入拟南芥中。在正常条件下，野生型（WT）和GhMPK10过表达系（OE）的子叶绿化率和生长状况相似。然而，在干旱和盐胁迫下，OE植株表现出显著高于WT的子叶绿化率和根长，表明GhMPK10过表达增强了转基因植株的干旱和盐胁迫耐受性。

在棉花中，研究人员利用病毒诱导基因沉默（VIGS）技术敲低GhMPK10的表达。携带PYL156:PDS载体的棉花植株出现白化表型，证实VIGS实验成功。RT-qPCR分析显示，VIGS植株（PYL156:GhMPK10-1, PYL156:GhMPK10-2, PYL156:GhMPK10-3）中GhMPK10的表达水平降低到对照植株的一半以下。用18% PEG处理4小时后，PYL156:GhMPK10植株的萎蔫程度比对照植株更明显。在模拟干旱胁迫下，PYL156:GhMPK10转基因植株的氧化胁迫指标发生显著变化：与对照组（PYL156）相比，转基因植株的丙二醛（MDA）含量显著增加，而超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）的活性显著降低，表明GhMPK10在调节棉花干旱胁迫下的抗氧化防御反应中起正向调控作用。

为了揭示GhMPK10沉默影响干旱胁迫响应的分子机制，研究人员进行了比较转录组分析。共获得510.29 M高质量清洁读数，Q20和Q30碱基的平均比例分别为97.53%和92.14%。样本间的相关性分析证实了RNA测序的重现性。差异表达基因（DEG）分析显示，GhMPK10在棉花干旱胁迫响应中具有重要的调控作用。

在不同处理组比较中，WT与VIGS比较有809个基因上调和487个基因下调；WT与WT_D比较有2,480个基因上调和3,977个基因下调；VIGS与VIGS_D比较有1,945个基因上调和1,421个基因下调。最显著的是WT_D与VIGS_D比较，显示3,801个基因上调和仅924个基因下调。这些发现强调了GhMPK10在调节干旱胁迫下转录组变化中的广泛调控作用，表明其在控制棉花胁迫响应的复杂调控网络中具有重要意义。

基因本体（GO）富集分析揭示了不同实验比较中独特的功能富集模式。WT与WT_D比较中鉴定的DEGs主要富集在与刺激响应、含氧化合物响应、细胞周边、质体和叶绿体相关的GO术语上。VIGS与VIGS_D比较的DEGs主要富集在刺激响应、化学响应、胁迫响应和细胞周边等方面。而WT_D与VIGS_D比较的DEGs主要富集在细胞周边、质体 envelope、质体类囊体、叶绿体类囊体、辐射响应、光刺激响应和氧化还原酶活性等相关术语上。

KEGG通路富集分析揭示了不同实验比较中独特的功能模式。在WT与WT_D比较中，DEGs主要富集在代谢、碳水化合物代谢和蛋白质家族：代谢相关通路上。相反，VIGS与VIGS_D比较的DEGs显示在信号转导通路（包括MAPK信号通路-植物和植物激素信号转导）、环境信息处理、转录因子、转运蛋白、代谢和蛋白质家族：代谢等方面显著富集。这一模式表明沉默GhMPK10调节了棉花中干旱响应信号机制。同时，WT_D与VIGS_D比较中的DEGs主要富集在代谢、碳水化合物代谢、蛋白质家族：代谢以及蛋白质家族：信号和细胞过程等方面。这些结果表明GhMPK10沉默重塑了信号架构，以增强棉花在持续干旱下的调控适应性。

KEGG通路富集显示，VIGS与VIGS_D之间的DEGs主要富集在MAPK信号通路和植物激素信号转导中。研究人员检测了参与ABA诱导的胁迫适应、气孔关闭和乙烯诱导防御响应关键基因的表达模式。与WT相比，在干旱条件下观察到PYR/PYL基因（包括Gh_D10G2388、Gh_A05G2630、Gh_A10G0340、Gh_D06G1764和Gh_D05G2920）显著下调。MAP3K17/18基因Gh_A05G1471和MKK9基因（包括Gh_A03G1976和Gh_D12G2575）在干旱条件下与WT相比显著上调。相反，两个ABF家族基因Gh_D09G0925和Gh_A09G0900在干旱条件下与WT相比显著下调。PP2C和SnRK2家族基因在GhMPK10沉默植株和WT植株中表现出相似的表达模式。这些基因表达的协调变化增强了GhMPK10沉默植株对干旱胁迫的敏感性。

棉花胁迫响应的调控涉及一个非常复杂的网络，其中许多基因、蛋白质和代谢物相互作用。因此，研究人员使用在线工具STRING搜索GhMPK10相互作用的基因。结果显示GhMPK10与八个基因有强相互作用，包括两个MKK4（GhMAPKK9和GhMAPKK10）、两个MKK3（GhMAPKK8和GhMAPKK2）、两个GhPTP1、一个GhACS1和一个GhSPCH。这些基因在调节植物非生物胁迫耐受性中的关键作用已得到证实。

在这些基因中，GhSPCH（Gh_D12G2689）在WT与VIGS和WT_D与VIGS_D比较中均表现出超过4倍的显著下调，而GhACS1（Gh_D12G2746）在WT与VIGS比较中显著上调，但在WT_D与VIGS_D比较中未显示显著差异表达。这表明GhACS1需要MPK10介导的信号来激活干旱胁迫响应。

本研究通过对棉花MAPK基因家族的全基因组鉴定和系统分析，揭示了GhMPK10在调控非生物胁迫耐受性中的核心作用。研究结果表明，GhMPK基因家族在棉花中经历了明显的扩张，56个成员被分为四个进化组，具有不同的基因结构和保守 motif。表达分析显示大多数GhMPK基因在多个组织中表达，并在非生物胁迫下被诱导表达，表明它们参与棉花发育和胁迫响应过程。

功能验证证实GhMPK10是提高多胁迫耐受性的关键候选基因。过表达GhMPK10增强了拟南芥的盐和渗透胁迫耐受性，而沉默GhMPK10则增加了棉花植株对干旱胁迫的敏感性。转录组分析表明，GhMPK10通过调节MAPK信号通路、植物激素信号转导和环境信息处理等通路来调控干旱胁迫响应。蛋白互作网络分析发现GhMPK10与多个关键胁迫响应基因相互作用，包括MAPKKs、PTPs、ACS和SPCH等。

这项研究首次鉴定出GhMPK10作为通过磷酸化信号调控非生物胁迫耐受性的关键调节因子，为培育抗逆棉花品种提供了有价值的分子靶标。研究结果不仅增进了对棉花MAPK信号网络的理解，而且为其他作物的抗逆育种提供了重要参考。未来的研究可以进一步解析GhMPK10与互作基因的具体调控机制，以及利用这些基因进行分子育种的实际应用价值。