钙离子转运蛋白CAX家族的进化与功能多样性及其对喀斯特植物高钙适应性的启示

《BMC Plant Biology》：Evolution and diversification of Ca2+/H+ exchangers: insights into karst-plant adaption to high-calcium environment

本研究针对植物Ca2+/H+交换剂(CAX)家族进化轨迹不清的问题，通过对49种绿色植物216个CAX蛋白进行系统发育和表达分析，揭示了CAX家族在种子植物中的扩张模式及Primulina属S-簇变异对高钙环境的适应机制，为植物钙信号调控和逆境适应提供了新见解。

　　

钙离子是植物生长发育和信号转导过程中不可或缺的矿物质元素。在植物细胞中，细胞质钙离子浓度被严格调控在约100 nM水平，比细胞外空间低约10,000倍。这种精确的调控需要一套高度完善的钙离子储存和运输系统，既能防止细胞内钙毒性，又能为信号传导提供瞬态波动。液泡作为钙离子的主要储存场所，通过隔离过量游离钙离子来避免细胞毒性，并在信号事件需要时释放钙离子。在这一过程中，阳离子/H⁺交换剂(CAX)发挥着关键作用，负责介导钙离子进出液泡的运输。

CAX是Ca²⁺/阳离子逆向转运蛋白(CaCA)超家族的成员，介导多种阳离子的运输。这些跨膜蛋白由11个跨膜结构域组成，排列成两个伪对称重复序列。CAXs参与多种重要的生理过程，包括钙信号传导、离子稳态调节和应对环境胁迫。在拟南芥中，已鉴定出六个CAX基因。值得注意的是，CAX1基因通过将钙离子运输到液泡中来调节细胞质钙离子稳态，从而防止细胞质钙离子积累。这种调控对植物正常生长和应对生物和非生物胁迫至关重要。

尽管CAXs的功能重要性已得到确认，但CAX基因家族在绿色植物中的起源和进化历史仍不清楚。特别是对非模式植物，尤其是适应特殊环境如喀斯特高钙地区的植物中CAX基因家族的进化和适应作用研究甚少。Primulina属(苦苣苔科)植物广泛特化于石灰岩喀斯特地区，是研究植物对这些环境适应的理想材料。

在这项发表于《BMC Plant Biology》的研究中，Yang等人对绿色植物中CAX基因家族进行了系统研究。研究人员通过对49种植物基因组数据的分析，鉴定了216个CAX蛋白，涵盖了从藻类到真双子叶植物的广泛植物类群。研究通过系统发育分析、表达谱分析和选择压力分析，揭示了CAX基因家族的进化轨迹和功能多样性。

研究采用的主要技术方法包括：从公共数据库获取49种植物基因组数据，使用HMMER3软件和BLASTP搜索鉴定CAX同源序列；通过MAFFT进行多序列比对，IQTREE构建最大似然系统发育树；利用MEME进行保守基序分析，HyPhy进行分支位点模型的正向选择检测；从多个数据库获取基因表达数据，分析组织特异性表达模式；对Primulina属12个物种进行转录组数据分析S-簇变异分布。

CAX基因家族在不同植物物种中的鉴定和分类

研究人员在46个物种中鉴定出216个CAX蛋白，代表了从藻类到真双子叶植物的广泛植物类群。CAX数量从低等植物到高等植物呈现显著扩张趋势。藻类通常只拥有单个CAX蛋白，而基础链形植物粗枝轮藻已经拥有两个CAX同源物，表明CAX基因多样化起源于链形植物谱系早期。

系统发育分析将植物CAX蛋白分为两个主要分支：Clade 1和Clade 2。藻类分支作为外群独立定位，不包括在两个主要分支中。Clade 1比Clade 2包含更多基因(122 vs 87)。Clade 2仅由种子植物出现后形成的CAX组成，而石松类和蕨类的所有CAX都被归类到Clade 1中。

植物CAX基因家族的进化关系

系统发育和结构分析揭示了CAX蛋白起源和进化历史的关键见解。排除藻类CAX分支，其余分支主要由陆地植物CAX组成。系统发育树明显将藻类CAX与陆地植物CAX分开，表明所有陆地植物CAX共享一个共同的祖先起源。值得注意的是，苔藓植物、蕨类和石松类等早期陆地植物的CAX被归入Clade 1，表明该分支更为保守。

为了进一步阐明种子植物CAX之间的进化关系，研究人员构建了专注于种子植物的ML树，以蕨类和石松类作为外群。在该分析中，种子植物CAX分为两个不同的分支：Clade 1和Clade 2，两者都包含所有主要种子植物谱系的代表。此外，Clade 1显示出额外复制事件的证据，导致形成亚支1-1和1-2。裸子植物在Clade 1内的基础位置表明裸子植物代表了一个早期分化的谱系，可能早于亚支1-1和1-2的分化。

种子植物进化过程中CAX的扩张和丢失

种子植物中的CAX基因家族在进化过程中经历了显著的分化。为了研究该家族内的扩张和丢失模式，研究人员为种子植物CAX蛋白系统发育树的每个亚支构建了ML树。系统树中裸子植物的单系群支持一个主要反映被子植物CAX系统发育关系的拓扑结构。

CAX广泛分布于被子植物中，在不同亚支中观察到不同程度的拷贝数扩张。在基础被子植物中，无油樟保留了三个CAX拷贝，每个位于不同亚支的基部。相比之下，其他基础被子植物，如睡莲目的水盾草和芡实，表现出CAX基因的显著扩张。CAX同源物在三大被子植物分支中的广泛分布表明这些分支可能起源于被子植物分化前的共同祖先。

为了更好地理解CAX基因家族的进化动力学，研究人员用关键的全基因组复制(WGD)事件注释了系统发育树。Clade 1聚成两个主要分支，每个分支表现出不同的扩张和收缩模式。在Clade 1-1中，早期分化的被子植物，包括木兰类、金粟兰科和大多数单子叶植物，拥有单个CAX基因拷贝，表明Clade 1-1可能更为保守。特别是在经历了谱系特异性的σ/φ WGD事件后，禾本科在Clade 1-1内仅保留了一个CAX基因拷贝。相比之下，CAX家族在大多数真双子叶植物中发生了显著扩张。

与Clade 1-1中的保守模式不同，Clade 1-2作为包含49个CAX蛋白的最小亚支，经历了显著的基因扩张，可能是由早期单子叶植物中的古老WGD(τ事件)驱动的。此外，在某些禾本科物种中观察到进一步的复制事件。相反，大多数真双子叶植物在Clade 1-2中显示出CAX基因拷贝数的减少，通常仅保留单个拷贝，而拟南芥在该分支中完全缺乏CAX基因。

在Clade 2中，观察到CAX基因的大规模扩张，可能是由于核心真双子叶植物中的古老γ WGD事件，导致形成两个较小的亚支。值得注意的是，该分支中的大多数单子叶植物有两个或更多CAX拷贝，表明基因扩张也发生在单子叶植物中，可能与禾本科中更近期的φ WGD事件有关。

此外，研究人员重点关注了适应高钙环境的Primulina属中的CAX基因，观察到CAX基因家族的显著扩张。值得注意的是，Primulina的CAX基因在Clade 1-1中缺失。相比之下，Primulina在Clade 1-2和Clade 2中表现出显著的CAX基因扩张，保留了多个拷贝，表明这些CAX在Primulina物种中具有特殊的功能作用。

植物CAX基因的表达谱分析

为了探索CAX基因在不同植物组织和发育阶段的功能作用，研究人员使用四个代表性物种的转录组数据进行了比较分析。表达谱揭示了不同进化分支间的明显模式。

在Clade 1-1中，虽然在白花报春苣苔中未鉴定到CAX基因，但其他三个物种的CAX基因在花器官中高表达。在Clade 1-2中，玉米CAX基因在几乎所有组织中广泛表达，未观察到显著的组织特异性。然而，在水稻和白花报春苣苔中，CAX基因在根中的表达水平高于其他组织，表明这些物种的CAX基因可能具有根特异性功能。在Clade 2中，拟南芥的AtCAX3在花中表达最高，而AtCAX1在根和叶中表达较高。在白花报春苣苔中，PebCAX1/2在根中特异性表达，而PebCAX3/4在叶中表达水平极低，但对高钙胁迫有响应。

研究人员进一步分析了白花报春苣苔CAX基因在高钙胁迫下的表达模式。在100 mM高钙胁迫下，PebCAX1/2的表达在根中显著上调，特别是在胁迫早期(12小时)。相反，PebCAX3/4在叶中的表达水平极低，但对高钙胁迫有响应。PebCAX4的表达在高钙胁迫后显著下调。这些表达模式表明白花报春苣苔中的CAX基因经历了明显的功能分化，这可能有助于该物种应对高钙环境的适应策略。

CAX蛋白序列的基序和关键氨基酸残基分析

基因复制事件产生的多个基因拷贝可能表现出不同的基序结构，从而影响蛋白质功能。为了研究种子植物CAX蛋白的结构分化，研究人员分析了不同物种CAX的基序。结果显示Clade 1和Clade 2共享11个保守基序，每个分支包含两个独特基序。

使用AlphaFold3预测这两个蛋白质的三维结构，发现Clade 1特异性基序8和14与Clade 2特异性基序10共同形成一个单α螺旋。值得注意的是，Clade 2独有的基序12在CAX蛋白的N端形成一个α螺旋，使其与Clade 1中的AtCAX5区分开来。

有报道称，当在酵母中表达时，截短的拟南芥AtCAX1/3蛋白的钙离子运输能力在缺失N端区域后显著增强，该区域被鉴定为自抑制域。Clade 2中CAX蛋白的进一步序列比对表明，基序12包含一个由四个丝氨酸残基组成的丝氨酸富集簇(S-簇)，该簇在多个物种中保守。位于自抑制域中的S-簇响应外部钙离子水平升高而被CBL-CIPK模块磷酸化。有趣的是，S-簇中的突变发生在报春苣苔属物种中，其中位置1的丝氨酸被天冬酰胺取代，位置3的丝氨酸被脯氨酸取代。这些突变可能影响CAX基因如何响应外部钙离子，可能反映了报春苣苔物种对喀斯特地区高钙土壤的长期适应。

S-簇变异在Primulina中广泛存在

为了进一步研究S-簇变异在报春苣苔属中的普遍性，研究人员分析了该属12个物种的转录组数据。结果揭示了在7个物种中鉴定到S-簇变异，进一步证实了S-簇变异在报春苣苔属中的广泛存在。

此外，研究人员构建了四个物种CAX基因的同线性图谱：葡萄、拟南芥(模式植物)、白花报春苣苔(报春苣苔属代表物种)和长柄报春苣苔(另一种共存于喀斯特高钙环境的报春苣苔物种)。连续的同线性基因对在四个物种中被鉴定出来，表明这些基因高度保守，起源于共同的祖先基因组。尽管AtCAX1和AtCAX3与白花报春苣苔中的两个CAX显示同线性，但S-簇变异仅存在于白花报春苣苔中，突出了该属独特的适应分化。报春苣苔物种在喀斯特高钙环境中茁壮成长的能力可能归因于特化的S-簇突变，这些突变可能在这些挑战性条件下维持细胞钙离子稳态中发挥关键作用。

研究结论与意义

本研究通过对绿色植物CAX基因家族的系统发育和表达分析，揭示了CAX蛋白的进化轨迹和功能多样性。研究发现CAX基因起源于早期植物进化，甚至在红藻中也可检测到其存在。两个主要CAX分支在种子植物出现之前就已分化，随后通过全基因组复制事件在种子植物中进一步扩张。

研究首次报道了Primulina属CAX蛋白S-簇的关键变异，这些变异可能通过影响CAX蛋白的自抑制调节机制，增强植物对高钙环境的适应性。表达分析揭示了CAX家族内的组织特异性表达模式，Clade 1-1可能参与生殖器官的发育。

该研究不仅阐明了CAX基因家族的进化历史，还为理解植物如何通过基因家族扩张和功能分化适应特殊环境提供了新视角。特别是对喀斯特植物高钙适应机制的研究，为作物抗逆性改良和植物多样性进化研究提供了理论基础。研究发现CAX基因家族的扩张主要由多次WGD事件驱动，谱系特异性WGD事件在促进植物适应多样化环境中发挥关键作用。

这项研究填补了非模式植物CAX基因家族进化研究的空白，为植物钙信号调控和逆境适应机制提供了重要见解，对农业可持续发展和生物多样性保护具有重要理论意义和实践价值。