基于代谢组与转录组解析黑果枸杞花青素积累机制及LrUFGT功能验证

本研究针对黑果枸杞果实成熟过程中花青素积累模式及分子调控机制不清的问题，通过整合代谢组与转录组分析，系统揭示了花青素生物合成的动态规律。研究发现成熟期果实花青素含量显著提升（达12.83 mg/g），鉴定出氰啶类衍生物为关键呈色物质，并证实LrUFGT基因通过糖基化修饰增强花青素稳定性。该研究为高花青素种质创制提供了理论依据和关键靶点，对提升黑果枸杞营养品质与商业价值具有重要意义。

　　

在西北干旱地区的荒漠中，一种被誉为"黑色黄金"的植物——黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murray）正悄然绽放其独特的价值。这种茄科枸杞属的多年生灌木不仅能够耐受干旱和盐碱，其成熟的紫黑色果实更是富含花青素（anthocyanins），具有远超维生素C和维生素E的抗氧化活性，以及降血糖、抗炎、抗菌和抗衰老等多种生理功能。然而，尽管黑果枸杞及其衍生产品（如果汁和保健食品）已引起研究者、种植者和消费者的广泛关注，但果实成熟过程中花青素的积累规律及其分子调控机制仍不明确，这严重限制了该物种的品种改良和产业化开发。

为了解决这一科学问题，安徽农业大学生命科学学院的陈颖、范星瑶等研究人员在《BMC Plant Biology》上发表了最新研究成果。他们采用多组学整合分析策略，对黑果枸杞三个不同成熟阶段的果实（幼果期LR-1、转色期LR-2和成熟期LR-3）进行了系统研究，旨在揭示花青素生物合成的分子机制，并为高花青素种质资源的创制提供理论依据。

研究主要采用了以下关键技术方法：1）利用紫外分光光度法和高效液相色谱（HPLC）定量分析不同发育阶段果实的总花青素含量及组分；2）通过非靶向代谢组学技术鉴定差异代谢物，并结合KEGG通路富集分析筛选关键代谢途径；3）采用转录组测序（RNA-seq）筛选差异表达基因，并通过加权基因共表达网络分析（WGCNA）构建基因调控网络；4）利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）验证关键基因表达模式；5）通过原核表达系统获得LrUFGT重组蛋白并验证其酶活功能；6）采用酵母异源表达系统评估LrUFGT在盐和干旱胁迫下的保护功能。

花青素含量在黑果枸杞不同发育时期的比较分析

研究发现，黑果枸杞果实的花青素含量随着成熟过程显著增加，从幼果期的8.41 mg/g上升到成熟期的12.83 mg/g，表明花青素积累与果皮着色密切相关。抗氧化能力测定显示，总抗氧化活性和羟基自由基清除能力在成熟过程中均显著增强，其中LR-3的羟基自由基清除率高达34%。

高效液相色谱法测定黑果枸杞不同发育时期的花青素组分

HPLC分析揭示了三种花青素苷元的存在：氰啶（cyanidin）、天竺葵素（pelargonidin）和飞燕草素（delphinidin）。值得注意的是，幼果期仅检测到氰啶和天竺葵素，而飞燕草素仅在转色期和成熟期出现。峰面积计算表明，成熟期氰啶的积累占主导地位，提示氰啶类衍生物可能是果皮着色的关键色素。

黑果枸杞差异代谢物的比较分析

代谢组学分析共鉴定出119,163个代谢物，其中228个属于黄酮类代谢物。差异代谢物筛选（VIP>1且P<0.05）共得到2,168个显著差异表达的代谢物。KEGG富集分析显示，这些代谢物显著富集于类黄酮生物合成（flavonoid biosynthesis）和苯丙烷生物合成（phenylpropanoid biosynthesis）通路。进一步聚焦花青素合成通路，发现8个上调的差异代谢物，其中氰啶-3,5-二-O-葡萄糖苷（cyanidin-3,5-di-O-glucoside）、氰啶-3-槐糖苷-5-葡萄糖苷（cyanidin-3-sophoroside-5-glucoside）和天竺葵素（pelargonidin）在成熟期显著积累，被认为是导致黑果枸杞色泽变异的主要因素。

黑果枸杞差异基因的分析与鉴定

转录组测序共识别出30,992个差异表达基因（DEGs），其中LR-1 vs LR-3比较组的DEGs数量最多（6,905个）。GO功能富集分析显示，差异基因显著富集于"类黄酮生物合成过程（GO:0009813）"和"类黄酮葡萄糖醛酸化（GO:0052696）"等条目。KEGG通路分析进一步证实，苯丙烷生物合成、黄酮和黄烷醇生物合成通路中的基因可能与花青素积累相关。研究人员重点关注了花青素生物合成通路中的227个DEGs，包括结构基因（LrCHI、LrF3'H、LrF3'5'H、LrDFR、LrANS和LrUFGT）和转录因子（MYB和bHLH）。qRT-PCR验证表明，LrCHI、LrF3'H和LrF3'5'H的表达与总花青素含量呈显著正相关（PCC>0.9）。

WGCNA分析鉴定花青素合成相关差异基因

通过加权基因共表达网络分析（WGCNA），研究人员构建了9个基因模块，其中黑色和绿色模块与两类花青素代谢物高度相关。相关性网络分析（PCC≥0.8）显示，LrUFGT与氰啶-3,5-二-O-葡萄糖苷和氰啶-3-槐糖苷-5-葡萄糖苷呈正相关，而与飞燕草素、氰啶和天竺葵素-3-O-葡萄糖苷呈负相关，表明LrUFGT在花青素糖基化修饰中发挥关键作用。

LrUFGT的功能分析

研究人员克隆了LrUFGT的全长CDS序列（1,347 bp，编码448个氨基酸），亚细胞定位实验证实该蛋白定位于叶绿体。原核表达获得pCold-TF-His-LrUFGT重组蛋白（101.81 kDa），体外酶活实验证明该蛋白能够催化氰啶（cyanidin）生成氰啶-3-O-葡萄糖苷（cyanidin-3-O-glucoside）。此外，酵母异源表达实验表明，表达LrUFGT的酵母细胞在NaCl（盐胁迫）和甘露醇（干旱胁迫）处理下均表现出显著增强的耐受性，且该保护作用不依赖于花青素的生物合成。

本研究通过多组学整合分析，系统解析了黑果枸杞果实成熟过程中花青素积累的分子机制。研究发现，花青素含量和抗氧化活性随果实成熟显著增加，其中氰啶类衍生物（如氰啶-3,5-二-O-葡萄糖苷和氰啶-3-槐糖苷-5-葡萄糖苷）是果皮着色的关键物质。转录组分析揭示了LrCHI、LrF3'H、LrF3'5'H和LrUFGT等关键基因的协同调控作用，其中LrUFGT通过糖基化修饰增强花青素的稳定性和功能多样性。尤为重要的是，LrUFGT的异源表达能够显著提高酵母对盐和干旱胁迫的抗性，这为利用基因工程技术改良作物的非生物胁迫耐受性提供了新思路。该研究不仅深化了对花青素生物合成途径的理解，而且为黑果枸杞的品种改良和产业化开发提供了重要的基因资源和理论依据。