基于HERV-Fcount的肝细胞癌内源性逆转录病毒分析揭示预后新机制及治疗靶点

本研究针对肝细胞癌(HCC)中人类内源性逆转录病毒(HERVs)的系统性研究不足的问题，利用新型HERV-Fcount分析工具对254例HCC样本进行全转录组测序分析。研究发现206个与生存显著相关的差异表达HERVs，并揭示其通过调控邻近癌基因/抑癌基因影响HCC进展。研究证实TP53缺失和选择性剪接调节剂可调控HERVs表达，为HCC的预后评估和免疫治疗提供了新靶点。

　　

肝细胞癌是全球癌症相关死亡的第四大原因，五年生存率持续低于20%。这种恶性肿瘤的发展涉及慢性病毒感染、酒精消耗、非酒精性脂肪肝病、代谢紊乱以及遗传和遗传因素等多种因素。尽管手术是可切除HCC的主要治疗方法，但许多病例在不可切除阶段才被检测到，需要化疗或靶向治疗。尽管在这些方面取得了进展，但晚期诊断仍然构成重大挑战，通常导致患者只能接受姑息治疗。因此，识别HCC的早期诊断标志物至关重要。

人类内源性逆转录病毒(HERVs)作为逆转录转座子，占人类基因组的8%。大多数HERVs通过3000万年前遥远祖先的逆转录病毒感染进入种系，并以中性速率积累突变。HERVs的重新激活已在众多癌症中被观察到，并可影响肿瘤基因组的稳定性。在恶性细胞中，HERVs可以作为附近基因的替代启动子或增强子，导致肿瘤抑制基因(TSGs)的下调和癌基因的上调。此外，HERVs内的隐性转录起始位点可用于产生异常蛋白质编码mRNAs。这些变化导致癌症发展、进展、转移、免疫系统改变和化疗耐药。逆转录转座子与HCC的发展有关；然而，大多数研究都集中在LINE 1或特定的HERVs上，对整个HERVs谱系的研究有限。

最近的研究强调了HERVs作为几种肿瘤的新型诊断、预后和治疗反应生物标志物的潜在临床应用。使用去甲基化药物重新激活HERVs，从而诱导新抗原产生和抗病毒样免疫，已成为癌症治疗的新方法。过去，研究团队使用Telescope研究了HCC中HERVs的表达。在本研究中，他们使用了一种基于featureCounts的新方法(称为HERV-Fcount)，通过分析254例台湾HCC样本的总RNA测序(RNA-seq)数据来评估HERVs的定量变化，并将结果与之前使用Telescope的分析进行了比较。他们进一步敲低了TP53，以探索这种遗传改变对HERV激活的影响，并使用选择性剪接(AS)调节分子来研究HCC细胞系中的变化，探讨其临床应用的可能性。

研究团队主要采用了总RNA测序(RNA-seq)技术对254例HCC患者样本和34例癌旁组织进行测序，并利用自主研发的HERV-Fcount工具进行HERVs表达定量分析。通过DESeq2进行差异表达分析，采用生存分析评估HERVs表达与患者预后的关联，运用聚类分析进行分子分型，并通过体外实验验证TP53基因敲低和选择性剪接调节剂对HERVs及其邻近基因表达的影响。

HERV表达

研究发现3731个HERVs在254例癌组织和34例癌旁组织中存在差异表达，其中3536个在癌组织中上调，195个下调。主成分分析(PCA)显示基于500个变异度最高的HERVs表达谱可明显区分癌与癌旁组织。进一步生存分析鉴定出206个与患者总生存期显著相关的HERVs，其中147个高表达预示不良预后，59个低表达与不良预后相关。这些HERVs中38个具有完整逆转录病毒结构(pol、env、gag)，51个含两个病毒组分，74个仅含一个组分，43个仅含LTR序列。染色体分布圈图显示多个HERVs定位在癌症相关基因(如DLEU1、ZSWIM5)附近，提示可能的调控热点。

附近基因表达分析

对206个生存相关HERVs的附近基因分析发现299个关联基因，其中94个在癌组织中表达，58个为已知癌症相关基因，28个与HCC特异性相关。83个基因在癌与癌旁组织中共同表达，71个在癌组织中高表达。功能分析揭示这些基因参与增殖(KCNH5、LUCAT1)、转移(DACH2)、侵袭(RFX6、CENPI)等癌症关键进程。

HERVs与附近基因的协同调控

研究发现14个生存相关HERVs与其附近基因存在同向调控关系，其中11个为正调控(7个由两种方法共同检测，4个为HERV-Fcount独有)，3个为负调控(2个共同检测，1个独有)。例如上调的ERVLE_13q14.3与癌基因DLEU1重叠，两者高表达均与不良预后相关；而下调的ERVLE_4q33a与抑癌基因LINC01612相邻，两者低表达均预示不良预后。

基于HERVs表达的分子分型

通过无监督聚类将254例HCC分为HERV-H1、HERV-H2、HERV-H3和HERV-L四个亚型，各亚型间生存差异显著(p=0.00123)。HERV-H1亚型TP53突变率最高(p=0.02154)，而HERV-L亚型TERT启动子突变率最低(p=0.02923)。临床关联分析显示女性、高龄、高胆红素、高AFP、Edmondson-Steiner分级>II级以及HBV相关HCC患者更易出现HERV高激活且预后较差。

HERV-Fcount与Telescope的比较

HERV-Fcount较Telescope多检出26个生存相关HERVs和37个附近基因，且检测速度显著提升。通过RT-qPCR验证证实HERV-Fcount能有效识别独特HERVs和关联基因。

TP53敲低对HERVs及附近基因的影响

在TP53野生型HepG2细胞中敲低TP53基因后，38个HERVs(含9个重新激活)上调和60个(含29个沉默)下调；33个附近基因上调和38个下调，其中12个重新激活，17个沉默。这些基因多数与癌症进展相关，证实TP53缺失通过调控HERVs影响致癌进程。

AS调节分子的影响

4β-Hydroxywithanolide E处理Huh7细胞后，27个生存相关HERVs下调和24个上调；95个附近基因(69个下调和26个上调)表达变化超过1.5倍，其中包含多个癌症进展相关基因，表明AS调节剂可通过调控HERVs附近宿主基因影响HERVs表达。

本研究通过HERV-Fcount这一高效分析工具，系统揭示了HERVs在HCC中的表达谱及其临床意义。研究发现206个与预后相关的HERVs，并构建了基于HERVs的分子分型体系，证实HERVs高激活与TP53突变、HBV感染及不良临床病理特征显著相关。机制研究表明TP53缺失和AS调节剂可通过调控HERVs及其附近基因影响HCC进展。这些发现不仅为HCC预后评估提供了新型生物标志物，也为HERVs靶向治疗(如去甲基化药物与免疫联合治疗)提供了理论依据。研究还证实HERV-Fcount在HERVs检测中较传统方法更具优势，为今后HERVs研究提供了高效技术手段。总之，该研究深化了对HERVs在HCC中作用机制的理解，为开发新的诊断和治疗策略奠定了重要基础。