基于CMCTS/oHA原位水凝胶的高密度人源肝癌细胞血管化肿瘤模型构建及其在免疫细胞治疗中的应用

《Advanced Composites and Hybrid Materials》：Homogeneously cross-linked in situ hydrogel enclosing high-density human-cancer cells promotes vascularized in vivo tumor modeling for immune cell therapy

为解决传统异种移植模型成瘤率低、血管化不足及生物材料残留阻碍组织整合等问题，研究人员开发了一种基于羧甲基壳聚糖(CMCTS)和氧化透明质酸(oHA)的可注射、完全降解的原位水凝胶。该研究证实，该水凝胶能有效包裹高密度人源肝癌细胞，在体内完全降解后促进细胞凝聚形成实体瘤，并成功诱导宿主血管新生，为验证免疫细胞治疗提供了可靠的血管化人源化肿瘤模型。

　　

在癌症研究领域，动物模型是连接基础研究与临床应用的桥梁，尤其是在评估免疫细胞疗法等前沿治疗策略时，一个能够真实模拟人体肿瘤微环境的模型至关重要。然而，传统的异种移植模型常常面临“水土不服”的尴尬：单纯注射的癌细胞容易流失，难以形成稳定的实体瘤；而为了给癌细胞提供支撑，研究人员常使用水凝胶等生物材料，但这些材料往往降解缓慢，残留在体内会像一堵墙一样阻碍肿瘤组织与宿主组织的整合，导致血管无法长入，最终形成一个“缺氧”且无法被免疫细胞有效攻击的“孤岛”。

为了打破这一僵局，来自香港大学的研究团队在《Advanced Composites and Hybrid Materials》上发表了一项创新研究。他们开发了一种名为CMCTS/oHA的可注射原位水凝胶，它就像一个“智能的细胞运输车”，不仅能将高密度的人源肝癌细胞精准地运送到小鼠体内，还能在完成任务后“功成身退”，完全降解，为癌细胞形成血管化的实体瘤扫清障碍。

这项研究主要运用了以下关键技术方法：首先，通过化学合成制备了氧化透明质酸(oHA)，并利用核磁共振氢谱(¹H-NMR)和傅里叶变换红外光谱(FT-IR)验证了其结构；其次，通过流变学测试评估了水凝胶的力学性能；然后，将高密度的人源肝癌细胞（HepG2和Huh-7）包裹于水凝胶中，通过体外培养和体内皮下注射，观察细胞凝聚和肿瘤形成情况；最后，利用组织学染色（H&E、Masson's trichrome等）、免疫荧光染色（CD31、GPC3等）以及活体成像(IVIS)等技术，系统评估了肿瘤的血管化程度以及免疫细胞（巨噬细胞）在肿瘤内的浸润情况。

3.1 Preparation of oHA and characterization of CMCTS/oHA in situ hydrogels

研究人员首先成功合成了氧化透明质酸(oHA)，并通过¹H-NMR和FT-IR证实了醛基的成功引入。当oHA与羧甲基壳聚糖(CMCTS)混合时，两者通过席夫碱反应(Schiff base reaction)迅速交联，形成了一种透明的、具有自愈合能力的原位水凝胶。流变学测试表明，该水凝胶在低频下表现出稳定的弹性行为，且易于通过注射器挤出。最关键的是，体外降解实验显示，CMCTS/oHA水凝胶在磷酸盐缓冲液(PBS)中能够快速降解，21天内完全降解，这为后续细胞在体内的释放和凝聚提供了先决条件。

3.2 Preparation and characterization of high-density human-cancer cells loaded in CMCTS/oHA in situ hydrogels

接下来，研究人员将高密度的人源肝癌细胞（HepG2和Huh-7）包裹于CMCTS/oHA水凝胶中。体外培养结果显示，细胞在水凝胶中分布均匀，且随着水凝胶的降解，细胞开始自发凝聚，形成致密的三维细胞聚集体。活/死细胞染色证实，在培养7天后，细胞仍保持高活性，且聚集体结构完整。这表明该水凝胶不仅能有效递送细胞，还能为细胞提供一个支持其存活和自组装的微环境。

3.3 Degradation test of high-density human-cancer cells loaded in CMCTS/oHA in situ hydrogels via Balb/C mice subcutaneously

为了验证水凝胶在体内的降解行为，研究人员将包裹HepG2细胞的水凝胶注射到免疫健全的Balb/C小鼠皮下。组织学分析发现，注射后1周，水凝胶已完全降解，释放出的癌细胞与宿主组织紧密连接。虽然由于Balb/C小鼠的免疫排斥反应，肿瘤生长受限，但这一结果清晰地证明了CMCTS/oHA水凝胶在体内具备完全降解的能力，且降解后能促进移植细胞与宿主组织的整合。

3.4 Generation of vascularized tumor model of high-density human-cancer cells loaded in CMCTS/oHA in situ hydrogels in mice subcutaneously

为了构建血管化的肿瘤模型，研究人员将细胞-水凝胶复合物注射到免疫缺陷的SCID小鼠皮下。2周后，注射部位形成了肉眼可见的实体瘤。组织学分析显示，肿瘤组织内部出现了大量的新生血管，这些血管不仅分布在肿瘤表面，还深入肿瘤内部，形成了功能性的血管网络。与传统的Matrigel?对照组相比，CMCTS/oHA水凝胶组形成的肿瘤血管数量更多、面积更大，且没有残留的生物材料阻碍组织整合。这充分证明了该水凝胶在构建血管化肿瘤模型方面的优越性。

3.5 Adaptive immune cell therapy in the tumor model

最后，研究人员利用该血管化肿瘤模型来评估免疫细胞疗法的效果。他们通过尾静脉注射人源巨噬细胞，发现这些免疫细胞能够通过新生的血管网络，有效浸润到肿瘤组织内部，并在肿瘤血管周围形成“免疫中心”。与注射PBS的对照组相比，注射巨噬细胞的小鼠肿瘤内，宿主免疫细胞（小鼠CD45+细胞）的积累量增加了两倍以上。这表明，该模型能够真实地模拟免疫细胞在肿瘤微环境中的迁移和分布，为评估免疫细胞疗法的有效性提供了一个可靠的平台。

研究结论与讨论

本研究成功开发了一种基于CMCTS/oHA的可注射、完全降解的原位水凝胶，并将其应用于构建血管化的人源化肿瘤模型。该水凝胶不仅解决了传统异种移植模型中细胞流失和成瘤率低的问题，其完全降解的特性还避免了生物材料残留对组织整合和血管新生的阻碍。研究证实，该模型能够自发形成血管化的实体瘤，并成功模拟了免疫细胞（如巨噬细胞）通过血液循环向肿瘤组织的迁移和浸润过程。

这一模型的建立具有重要的科学意义和临床转化价值。它为评估新型免疫细胞疗法（如CAR-Macrophage）提供了一个更真实、更可靠的体内平台，有望加速癌症免疫治疗药物的研发进程。同时，该水凝胶作为一种简单、高效的细胞递送工具，也为组织工程和再生医学领域提供了新的思路。