综述：DNA折纸在生物医学中的应用：进展、挑战与展望

《Advanced Composites and Hybrid Materials》：Applications of DNA origami in biomedicine: advances, challenges, and prospects

本综述系统阐述了DNA折纸（DNA origami）作为一种可编程纳米材料在生物医学领域的革命性应用。文章重点探讨了其在药物递送、疫苗开发、组织工程、疾病治疗、临床检测及生物成像等方面的前沿进展，并深入剖析了该技术在稳定性、成本及体内行为等方面面临的挑战，为未来精准医疗和生物技术发展提供了前瞻性视角。

　　

DNA折纸（DNA origami）技术，作为一种革命性的自下而上（bottom-up）纳米制造策略，正以其无与伦比的程序化能力、纳米级空间寻址精度和优异的生物相容性，重塑着生物医学研究的格局。通过利用DNA碱基互补配对（Watson-Crick base pairing）原理，研究者能够将一条长链DNA骨架（scaffold）与数百条短链DNA（staple strands）进行精确杂交，从而折叠成从数十纳米到亚微米尺度、形态各异的二维（2D）或三维（3D）纳米结构。这些结构不仅可作为理想的“纳米绘图板”，用于精确排布药物、蛋白质、核酸及靶向配体，更在跨越药物递送、疫苗开发、组织工程、疾病治疗、临床检测及生物成像等多个前沿领域展现出巨大的应用潜力。

DNA折纸在药物递送中的应用

在药物递送领域，DNA折纸纳米结构（DNA origami nanostructures, DONs）凭借其高载药量、可编程的靶向性及可控的药物释放动力学，成为构建智能递送系统的理想平台。

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  CRISPR/Cas9基因编辑系统：针对CRISPR/Cas9系统递送效率低下的难题，研究者开发了基于DNA折纸的基因编辑系统。该系统通过设计富含原间隔序列邻近基序（protospacer-adjacent motif, PAM）的区域，利用PAM引导的组装和DNA/RNA杂交，高效招募并装载sgRNA/Cas9复合物。通过引入二硫键进行结构压缩，并修饰透明质酸（hyaluronic acid, HA）肽和DNA适配体（aptamer），该系统实现了靶向递送和有效的内涵体逃逸。在体内，该系统成功编辑了肿瘤相关基因（如PLK1），为基因治疗提供了新策略。
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  抗体-药物偶联物（ADC）类似物：DNA折纸可作为构建ADC类似物的理想支架。例如，通过将靶向前列腺特异性膜抗原（prostate-specific membrane antigen, PSMA）的DUPA配体以可控密度修饰在六螺旋束DNA折纸（6HB DON）上，并利用双链DNA（dsDNA）嵌入化疗药物多柔比星（doxorubicin, Dox），构建了具有高载药量的靶向递送系统。研究表明，靶向配体的数量显著影响其治疗效果，为开发高耐受剂量的新型纳米药物提供了可能。
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  胞质直接递送：为解决药物在胞质递送中的内涵体/溶酶体捕获难题，研究者开发了CytoDirect DNA纳米器件。该器件在DNA折衣框架上整合了二硫键和HER2亲和体（affibody）修饰。二硫键单元促进了药物的快速胞质内化，而HER2亲和体则通过将二硫键单元与细胞膜上的硫醇基团拉近，显著加速了膜穿透过程。该系统在HER2过表达的癌细胞中实现了高效的胞质摄取，并成功递送了治疗性寡核苷酸和小分子抗癌药物。
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  急性肾损伤（AKI）治疗：针对急性肾损伤，研究者开发了一种DNA纳米筏（nanoraft），用于递送白细胞介素-33（interleukin-33, IL-33）。该纳米筏通过在矩形DNA折纸（Rec-DON）上精确排布IL-33纳米阵列，实现了IL-33向肾脏的优先和特异性递送。在缺血性AKI小鼠模型中，该纳米筏通过促进先天性淋巴细胞2（ILC2s）和调节性T细胞（Tregs）的扩增，有效促进了肾损伤修复。

DNA折纸在疫苗开发中的应用

DNA折衣在疫苗开发中扮演着关键角色，其精确的纳米级结构控制能力为优化抗原呈递和免疫应答提供了独特优势。

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  DoriVac疫苗平台：研究者利用方形块状（square-block, SQB）DNA折纸技术，开发了DoriVac疫苗平台。该平台能够精确控制CpG佐剂（adjuvant）的纳米间距（2.5-7.0 nm），以研究其对免疫应答的影响。研究发现，当CpG间距为3.5 nm时，能够有效诱导树突状细胞（dendritic cells, DCs）的Th1极化免疫应答，并促进抗原交叉呈递（cross-presentation）和CD8⁺T细胞的活化。该平台与抗程序性死亡配体1（anti-PD-L1）疗法联用，在黑色素瘤和淋巴瘤模型中显示出协同增效作用。
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  多病原体靶向疫苗：DoriVac平台被重新用于开发针对SARS-CoV-2、人类免疫缺陷病毒（HIV）和埃博拉病毒（Ebola）的多病原体靶向疫苗。通过将肽-寡核苷酸偶联物（peptide-oligonucleotide conjugates）通过点击化学（click chemistry）连接到SQB纳米颗粒上，该平台实现了CpG佐剂和疾病特异性HR2抗原的共同递送。在SARS-CoV-2-HR2疫苗中，该平台诱导了强烈的抗原特异性T细胞活化，展示了其在开发通用疫苗方面的潜力。
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  异源POINT技术：为应对病毒变异，研究者开发了异源抗原正交呈递纳米拓扑结构（heterotypic antigens presented orthogonally in nanoscale topography, hetero-POINT）技术。该技术利用DNA足球框架（DNA soccer-ball framework, DSF）和两种正交选择性的适配体，在纳米尺度上精确排布原始SARS-CoV-2刺突蛋白三聚体和奥密克戎（Omicron）变异株的受体结合域（receptor-binding domain, RBD）。通过调控抗原的间距、化学计量和分布，该技术成功构建了能够同时靶向原始毒株和变异株的嵌合纳米颗粒疫苗。

DNA折纸在疾病治疗中的应用

DNA折纸在疾病治疗中的应用，特别是在调控细胞信号通路和构建多功能治疗平台方面，展现出巨大潜力。

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  类风湿关节炎（RA）治疗：研究者利用DNA折纸技术，构建了在二维六边形构型中排列CD95L（Fas配体）阵列的纳米结构。该结构整合了I-motif DNA序列，能够在炎症组织微酸性（pH~6.5）环境下发生构象转变，暴露出CD95L阵列，从而特异性激活活化免疫细胞中的CD95死亡诱导信号通路，诱导细胞凋亡。在胶原诱导的关节炎小鼠模型中，该策略成功逆转了疾病进程，且未观察到明显的副作用。
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  动脉粥样硬化（AS）治疗：针对动脉粥样硬化，研究者开发了cRGD/ASOtDON纳米制剂。该制剂由环状RGDfK（cRGD）肽、抗miR-33反义寡核苷酸（ASO）和三角形DNA折纸（tDON）组成。cRGD靶向avβ3整合素，促进纳米颗粒在AS相关细胞中的摄取；抗miR-33通过下调miR-33促进胆固醇外流；而tDON则作为纳米载体，并具有清除活性氧（ROS）的能力。该制剂在AS小鼠模型中显示出优异的治疗效果，且所需剂量远低于临床药物丙丁酚（probucol）。
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  急性肾损伤（AKI）的早期诊断与治疗：研究者开发了一种miR-21响应的DNA折纸纳米天线（nanoantenna），用于AKI的早期诊断和智能治疗。该纳米天线由两个微型金纳米棒（AuNRs）通过矩形DNA折纸（rDON）连接而成。在AKI模型中，过表达的miR-21会与AuNRs结合，导致其从rDON支架上释放，从而关闭光声（photoacoustic, PA）信号，实现快速诊断。同时，释放的rDONs具有高达94.3%的ROS清除效率，可有效缓解局部氧化应激。
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  抗菌治疗：研究者利用DNA折纸构建了一种杀菌剂，用于治疗感染性伤口。该杀菌剂通过一锅法组装形成有序的G4阵列，并通过G4与DNA双链的特异性识别，整合了左氧氟沙星（levofloxacin, LEV）和细菌膜破坏剂（G4/血红素（hemin）单元）。在治疗过程中，G4/血红素单元产生的ROS破坏了细菌膜，随后LEV进入细菌内部抑制其增殖。该策略实现了靶向和协同的抗菌治疗，促进了感染伤口的愈合。

DNA折纸在组织工程中的应用

DNA折纸在组织工程中作为理想的支架材料，能够精确调控细胞-细胞、细胞-基质相互作用，为构建仿生组织模型提供了新工具。

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  T细胞检测与激活：研究者利用DNA折纸构建了pMHC多聚体（dorimers），用于检测抗原特异性T细胞。通过控制pMHC的间距和价态，dorimers能够以高亲和力、慢解离动力学和低背景干扰的方式识别T细胞受体（TCR）。此外，DNA折纸还被用作人工抗原呈递细胞（aAPCs），通过精确排布TCR配体（pMHC）和共刺激配体（如抗CD28抗体），有效激活和扩增T细胞，用于过继性T细胞免疫治疗。
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  标准化球体生产：研究者利用自组装核酸纳米结构修饰活细胞（NACs），生成了具有可编程三维结构的标准化球体。该方法能够快速生成尺寸均一、可重复的球体，并允许在空间上精确控制多种细胞类型的定位，从而模拟天然组织的微解剖结构。该策略可用于构建具有免疫串扰的肿瘤微环境模型，为药物筛选和毒理学研究提供了更生理相关的平台。
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  TRAIL三聚体构建：研究者利用“雕刻-打印”（engraving-printing）策略，在平面矩形DNA折纸上高效修饰了三个TRAIL（肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体）单体，构建了DNA-TRAIL3三聚体。通过精确调控配体间距，研究者发现当间距为40 nm时，DNA-TRAIL3-40展现出最强的受体结合亲和力、信号激活能力和诱导癌细胞凋亡的能力，其体内药代动力学和抗肿瘤特性也优于天然TRAIL单体。

DNA折纸在临床检测中的应用

DNA折纸凭借其高灵敏度和特异性，在临床检测领域，特别是在生物标志物检测和诊断技术开发中，展现出巨大应用价值。

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  血糖监测：研究者开发了荧光放大折纸微针（fluorescence-amplified origami microneedle, FAOM）装置，用于无创血糖监测。该装置将葡萄糖氧化酶（glucose oxidase）分子与DNA折纸纳米管整合在微针阵列内部。当微针插入皮肤后，收集的葡萄糖在氧化酶催化下产生质子信号，驱动DNA折纸纳米管发生机械变形，释放荧光分子，从而放大与血糖水平相关的荧光信号。该装置在临床测试中表现出高准确性和稳定性。
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  生物标志物检测：研究者开发了一种基于DNA折纸的载体/纳米孔生物传感平台。该平台利用DNA折纸结构中的空腔来容纳特异性结合靶标分子的DNA适配体。当靶标分子（如C反应蛋白，CRP）进入空腔时，易位离子电流会从双峰转变为单峰，从而实现生物标志物的定量检测。该技术具有高灵敏度和特异性，可用于检测复杂临床样本中的低丰度生物标志物。
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  表观遗传修饰检测：研究者利用DNA杂交动力学和超分辨率DNA-PAINT显微镜，开发了一种检测表观遗传胞嘧啶修饰的方法。该方法通过分析瞬时寡核苷酸杂交的动力学，能够以单分子分辨率识别和区分不同的胞嘧啶修饰，为表观遗传学研究提供了新工具。
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  多抗原识别：研究者开发了可编程的二维DNA折纸纳米阵列，用于多抗原识别。该阵列通过调整价态和间距，增强了与靶细胞的结合亲和力。通过修饰特异性适配体，该阵列能够捕获异质性循环肿瘤细胞（circulating tumor cells, CTCs），为癌症诊断和液体活检提供了新策略。

DNA折纸在生物成像中的应用

DNA折纸在生物成像中作为多功能探针，能够显著提高成像的对比度、灵敏度和分辨率，为生命科学研究提供了强大的可视化工具。

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  靶向拉曼成像：研究者开发了名为SPECTRA的纳米探针，用于转移性前列腺癌（PCa）的靶向拉曼成像。该探针利用DNA折纸模板自组装金纳米棒（AuNRs）二聚体，形成纳米天线结构，并修饰靶向DU145转移性前列腺癌细胞的DNA适配体。该探针在细胞沉默区（2225 cm^-1）产生独特的拉曼峰，实现了对癌细胞的精确、灵敏和靶向成像。
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  冷冻电镜（cryo-EM）样品制备：研究者开发了一种基于DNA折纸的DNA亲和网格（DNA affinity grid）技术，用于冷冻电镜样品制备。该技术利用多层DNA折纸构建微米尺度的二维蜂窝状晶格，能够有效捕获和浓缩目标脂质囊泡，并去除蛋白质污染物。该技术简化了异质性样品的纯化步骤，为复杂生物组装体的可视化提供了新方法。
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  基因定位：研究者开发了一种基于DNA折纸标签的基因定位方法。该方法利用“三嵌段”（tri-block）DNA结构，通过引物域识别和标记重复序列，并通过捕获域与DNA折纸探针选择性连接。结合原子力显微镜（AFM），该方法能够以6.5 nm的超高分辨率对基因组中的重复序列进行直接测序和定位。
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  无标记检测：研究者开发了origamiFISH技术，用于细胞和组织内单分子DNA折纸的无标记荧光检测。该技术利用M13mp18噬菌体基因组中的保守序列设计探针，通过杂交链式反应（hybridization chain reaction, HCR）进行信号放大，能够以高灵敏度检测皮摩尔浓度的DNA折纸，并对其生物分布进行精确分析。

优势、挑战与未来展望

尽管DNA折纸在生物医学应用中展现出巨大潜力，但其临床转化仍面临诸多挑战。首先，DNA折衣在生理条件下的稳定性是主要瓶颈，尤其是在低Mg²⁺浓度和核酸酶（DNase）存在的环境中，其结构完整性易受破坏。其次，DNA折纸的体内药代动力学、生物分布和代谢途径尚不完全清楚，其潜在的免疫原性和脱靶效应也需要系统评估。此外，DNA折衣的大规模生产成本高昂，限制了其商业化应用。

为克服这些挑战，未来的研究应致力于开发新的稳定化策略，如引入化学修饰（如硫代磷酸酯键）或包覆保护层。同时，需要深入探究DNA折纸的体内行为，并开发更具成本效益的生产方法，如利用工程化噬菌体进行体内生产。随着这些关键问题的解决，DNA折纸技术有望在精准医疗、生物技术和材料科学等领域发挥更加重要的作用，为人类健康带来革命性的突破。