稳定D2多巴胺受体寡聚体揭示β-抑制蛋白（β-arrestin）偏向性信号转导的多态复合物

本研究通过分子对接模拟与生物物理技术相结合，成功设计出稳定的D2多巴胺受体（D2R）同源二聚体突变体（V96S/V97C）。研究发现该突变体显著增强受体寡聚化稳定性，并驱动β-arrestin-2（Barr2）偏向性信号通路，表现为配体非依赖性Barr2招募、加速内化及ERK信号重编程。该研究为GPCR二聚体靶向药物设计提供了新策略。

　　

多巴胺受体是大脑中调控运动、奖励和强化机制的关键分子，其功能异常与精神分裂症、帕金森病等神经系统疾病密切相关。尽管G蛋白偶联受体（GPCR）作为最大膜蛋白家族已成为35%临床药物的靶点，但D₂多巴胺受体（D₂R）通过形成同源或异源寡聚体实现信号多样化的机制仍不明确。尤其缺乏高分辨率二聚体结构限制了靶向这些复合物的药物开发。传统观点认为GPCR主要通过G蛋白传递信号，但近年来发现β-抑制蛋白（β-arrestin）介导的信号通路具有重要生理意义。然而，受体寡聚化如何影响β-arrestin功能仍存在争议：有些研究表明寡聚化会抑制β-arrestin招募，另一些却显示β-arrestin能促进二聚体形成。这种矛盾凸显了该领域的认知空白。

为破解这一难题，Katie L. Sharrocks等人在《Nature Communications》发表研究，通过整合计算模拟与实验验证，成功设计出稳定的D₂R同源二聚体，揭示其通过特定空间构象促进β-arrestin-2（Barr2）偏向性信号的新机制。研究人员采用分子对接模拟预测二聚体界面，通过点突变（Y93C/V96C/V96S/V97C）稳定相互作用，并运用Western blot、生物发光共振能量转移（BRET）、流式细胞术和超分辨显微镜（PD-PALM）等多技术手段验证寡聚化状态及功能变化。

D2R突变增强同源二聚体稳定性与原体邻近度

通过分子对接模拟发现，对称性D₂R同源二聚体（两个原体均处于激活态）形成以H1-H1、H1-H2和H2-H2接触为特征的界面。选择Y93C、V96C、V96S和V97C等位点进行突变后，Western blot显示V96S/V97C双突变体在还原条件下仍保持更高比例的二聚体/寡聚体形式。BRET饱和实验证实这些突变体保持与WT相似的结合亲和力（BRET₅₀），但V96S/V97C表现出更高的最大能量转移效率（BRET_max）。计算模拟进一步预测双突变体界面比WT更紧密，其中C97与对面原体的C97和Y93形成相互作用。

超分辨成像揭示D2R V96S/V97C突变体寡聚化增强

PD-PALM技术（分辨率<10 nm）直接观测细胞膜表面受体分布发现，V96S/V97C突变体的单体比例显著低于WT，而二聚/寡聚体比例相应增加。这些寡聚体以二聚体为主（约占总受体17%），但也包含高阶寡聚体。奎吡罗刺激后，V96S突变体寡聚比例显著降低，可能与配体诱导的内化有关，而WT和V96S/V97C的寡聚状态无显著变化。受体密度分析表明，突变体的寡聚化差异并非由表达量差异引起。

D2R突变体改变Gai信号与Barr2招募模式

cAMP抑制实验显示突变体对奎吡罗的效能（EC₅₀）与WT无差异，但V96S/V97C的最大Gαi反应显著降低。BRET实时动力学分析发现，V96C突变体招募Barr2的半衰期显著缩短，V96S和V96C突变体对奎吡罗的敏感性提高（EC₅₀降低）。尤为重要的是，V96S/V97C表现出基础状态下Barr2结合增强，表明构成性激活Barr2通路。这些变化与受体表达水平无关，因为低表达WT并未重现该表型。

构成性与配体诱导的受体内化增强

流式细胞术检测发现，V96S/V97C突变体的细胞表面表达低于WT，但其构成性内化率显著增加。所有突变体在奎吡罗刺激后均表现出更强的内化效应，其中V96S/V97C最为显著。共聚焦显微镜进一步证实突变体内化增强的表型。降低WT表达量并不能模拟该现象，说明内化增强是突变体固有特性而非表达量差异所致。

促进Barr2招募的D2R偏好Barr2介导的ERK信号

在HEK293细胞中，WT与突变体D₂R均能诱导ERK磷酸化，但V96C在5分钟刺激时响应增强，而V96S/V97C呈现更快动力学特征。在Barr1/2敲除细胞中，WT仍保留部分ERK激活能力，但所有突变体的ERK信号均显著减弱，表明其ERK信号转导依赖Barr2。这表明突变体通过稳定寡聚化将信号通路转向Barr2依赖性机制。

D2R二聚体与G蛋白或抑制蛋白的差异化学计量

分子对接预测显示，D₂R同源二聚体与Gαi复合物呈2:1化学计量，但两个G蛋白异源三聚体同时对接会产生空间冲突。相反，D₂R二聚体与Barr2的对接始终支持2:2化学计量，其中Barr2的指状环插入受体由H3/H6胞质延伸段、IL1、IL2和H8形成的结合口袋，中环和β-发夹结构则与IL2和H5相互作用。这种结构排列与多种GPCR二聚体-抑制蛋白复合物的报道一致，包括mGluR3和mGluR8。

研究结论表明，通过精准设计D₂R同源二聚体界面突变，成功实现了受体寡聚化稳定与功能重编程。V96S/V97C突变体不仅增强二聚体稳定性，还构成性促进Barr2招募、加速内化并使ERK信号转向Barr2依赖途径。分子模型提示D₂R二聚体更易形成2:2受体:Barr2复合物而非2:1受体:G蛋白复合物，从结构层面解释了信号偏向性机制。该研究首次将D₂R寡聚化与Barr2偏向性信号直接关联，为针对GPCR二聚体的选择性药物设计提供了新范式。

这项研究的突破性在于超越了传统单体受体研究范式，通过理性设计二聚体界面突变，揭示了寡聚化作为调控信号偏向性的内在机制。不仅为精神分裂症等疾病中D₂R寡聚化增多的病理现象提供了分子解释，更为开发靶向特定GPCR寡聚体构象的精准药物开辟了新道路。