细胞毒性镜像纳米孔构建及其在单分子传感与癌症治疗中的应用研究

为解决天然蛋白质纳米孔的结构复杂性和功能局限性问题，研究人员开展了镜像肽纳米孔DpPorA的构建与功能研究。通过系统表征发现该孔道具有高电导率（3.80±0.2 nS）和阴离子选择性（PK+/PCl-=1:20），可实现多肽、PEG化多肽、α-突触核蛋白和环糊精的单分子检测。分子动力学模拟证实其精确镜像结构，细胞实验显示DpPorA DE对癌细胞具有特异性膜破坏作用（存活率降低27.21%），为纳米孔传感和靶向治疗提供了新策略。

　　

在纳米生物技术领域，膜蛋白纳米孔因其精确的原子级结构设计和多样化的应用前景而备受关注。从DNA测序到单分子传感，天然β-桶状蛋白孔和人工设计的α-螺旋肽孔都在推动技术进步。然而，天然蛋白质孔的复杂工程化过程和纯化难题，以及DNA纳米结构的电泄漏问题，限制了其更广泛的应用。特别是在癌症治疗领域，虽然α-螺旋肽在靶向治疗和药物递送中显示出潜力，但如何构建结构稳定、功能可控且具备生物相容性的合成孔道仍是一个重大挑战。

此前研究虽成功将非天然D-氨基酸整合到肽序列中形成功能孔道，但始终缺乏确凿证据证明这些孔道具备真正的镜像结构。更关键的是，如何通过理性设计调控孔道的电荷分布以增强其分子选择性和电导性能，以及如何将这类合成孔道应用于复杂生物环境（如细胞膜）中的分子传输和疾病治疗，仍是未解的难题。

针对这些问题，发表在《Nature Communications》的最新研究给出了突破性解决方案。研究团队通过全化学合成构建了首个人工镜像肽纳米孔DpPorA，并系统阐明了其结构特征、功能性能及生物医学应用潜力。该研究不仅证实了镜像纳米孔在单分子检测中的卓越性能，更开创性地展示了其在癌症靶向治疗中的应用前景，为纳米孔技术的发展开辟了新方向。

研究人员主要采用了几项关键技术方法：通过固相肽合成和高效液相色谱纯化制备D-氨基酸肽；利用圆二色光谱验证α-螺旋构象；采用平面脂质双分子层电生理记录技术分析单通道特性；通过分子动力学模拟（CHARMM36-m力场）研究孔道结构和分子传输机制；使用巨型单层囊泡（GUV）模型评估分子跨膜运输；选用MDA-MB-231三阴性乳腺癌细胞系和MCF10A正常乳腺细胞进行细胞毒性实验（MTT法）和膜完整性检测（CellMask染色）。

单通道表征和功能稳定性

研究团队首先化学合成了由40个D-氨基酸组成的DpPorA肽，圆二色光谱显示其具有与L型对应物相反的椭圆率，证实了镜像结构。电生理记录表明，DpPorA在DPhPC平面脂质双层中形成均匀孔道，平均单通道电导为2.80±0.2 nS（1 M KCl，+50 mV）。该孔道在±25 mV至±100 mV电压范围内保持稳定开放状态，在±150 mV以上出现门控现象。选择性测量显示其阴离子优先透过性（P_K+/P_Cl-=1:3）。值得注意的是，L型和D型孔道表现出几乎相同的电导特性，证实了它们作为精确镜像结构的特性。

DpPorA DE孔的电学和功能特性

通过对第28和31位点进行中性丙氨酸取代（E/D→A），研究人员设计了电荷模式优化的DpPorA DE变体。该变体形成了电导更高的均匀孔道（3.80±0.2 nS），并表现出更强的阴离子选择性（P_K+/P_Cl-=1:20）。实验证明，带负电的分析物如非谷氨酸九肽（E9）在正电压下产生电流阻塞事件，平均停留时间（T_off）为0.2±0.02 ms（+20 mV），证实了肽的易位。值得注意的是，PEG化的E9肽（PEG 200-E9）表现出更强的结合亲和力（K_D=0.5×10^-3 M），而阳性的PEG化非精氨酸九肽则不产生阻塞，证明了电荷选择性易位。

研究还探索了与天然无序蛋白α-突触核蛋白（αS）的相互作用。添加25 nM αS至孔道cis侧后，在正电压下产生了明确的三步阻塞事件，对应不同蛋白质构象。竞争性结合实验显示，E9、PEG 200-E9和αS产生互斥的电流阻塞，证明了孔道对多种分析物的选择性结合能力。

分子动力学模拟

通过CCBuilder2.0构建模型孔道并进行分子动力学模拟，结果显示D型孔道是L型孔道的精确镜像。RMSD分析表明孔道在500 ns无偏平衡过程中保持稳定。在+0.5V外加电场下，LpPorA和DpPorA的电导值相似（约3.5 nS），证实了它们作为镜像结构的特性。突变孔道LpPorA DE和DpPorA DE显示出更高的离子电导和阴离子-阳离子渗透比，与实验结果一致。

静电势图分析显示，DpPorA DE孔道沿孔腔内表面表现出更正的静电势，这是由于酸性氨基酸残基被替换后，赖氨酸残基主导的正电荷分布导致的。这种电荷分布的不对称性通过改变局部势能景观和水合环境影响了分子传输，导致这些孔道的电导值略有不同。

Steered Molecular Dynamics（SMD）模拟揭示了E9肽通过DpPorA和DpPorA DE的分子结合和易位动力学。将E9拉过DpPorA所需的力约为210 pN，通过DpPorA DE约为200 pN，无统计学显著差异。结构分析显示，E9保持灵活的非结构化构象，仅一端与赖氨酸残基发生静电相互作用，促进电荷选择性肽易位。

巨型单层囊泡系统中的组装和运输

研究人员在DOPC巨型单层囊泡（GUV）中检验了DpPorA和DpPorA DE的成孔活性。通过尺寸依赖性分析发现，这些肽能够形成大直径柔性孔道，促进亲水性荧光染料（Alexa Fluor 350 Hydrazide：349 Da；Alexa Fluor 555 Hydrazide：1150 Da；ATTO 488 Dextran：3000 Da）的跨膜运输。统计分析显示，DpPorA掺入的囊泡对这三种染料的渗透率分别为88.9±7.8%、67.9±10.4%和73.0±14.1%，而DpPorA DE则分别为89.2±3.7%、71.3±3.5%和53.8±8%。对照囊泡的渗透率均低于15%。研究还发现，镜像脂质DOPC（Cis和Ent）配置都支持有效的肽孔组装和可比的膜渗透性。

DpPorA和DpPorA DE肽对癌细胞的影响

研究测试了这些镜像肽在复杂哺乳动物细胞膜系统中的生物活性。实验发现，25μM DpPorA DE处理导致MDA-MB-231癌细胞存活率显著降低27.21%，且具有浓度依赖性（10μM、20μM和25μM分别对应11%、19%和27.21%的减少）。值得注意的是，20μM DpPorA DE对正常乳腺细胞MCF10A无显著影响。

通过CellMask Deep Red染色评估细胞膜完整性，发现DpPorA DE处理组中99.37%的细胞显示膜破坏表型，显著高于对照组的32.62%。进一步使用5-羧基荧光素（5-FAM）标记的DpPorA DE肽证实，这些肽能够有效融入活癌细胞的膜中，4小时即可检测到绿色通道信号，24小时后强度增加，表明时间依赖性的肽融入。

结论与意义

该研究成功设计并组装了由立体反转D-氨基酸组成的跨膜镜像纳米孔，这些功能性的镜像孔道结构稳定，表现出异常高的电导率，优于迄今为止报道的大多数合成孔道。通过简单的位点特异性电荷修饰，这些肽的离子电导和选择性显著提高，这是通过重新设计开放的β-桶状结构难以实现的。

分子动力学模拟数据建立了L型和D型pPorA孔道相似的螺旋堆积和半径分布，表明尽管氨基酸立体反转，但它们具有相同的结构孔道构象，促进了电荷选择性的离子和肽传输。更重要的是，大多数先前的荧光成像GUV分析都集中在抗菌肽上，这些肽非特异性破坏膜而不形成稳定孔道。而本研究显示了DpPorA在膜中插入并形成大直径柔性孔道的能力，使用GUV中的尺寸依赖性分析证明了这一点。

这些高疏水性和阳离子肽通过静电相互作用选择性靶向带负电的癌细胞膜，形成稳定孔道，研究最终证实5-FAM-DpPorA DE肽进入癌细胞膜，最终导致膜破坏和细胞活力丧失。使用生物稳定的非天然D肽可能具有诱导免疫耐受的额外优势，这作为体内治疗策略将是有益的。

该研究的发现表明，这类镜像孔道可以推动分子传感器和治疗药物的开发。特别是在三阴性乳腺癌等缺乏靶向治疗方案的癌症类型中，这类肽孔道可能提供新的治疗策略。稳定镜像孔道在平面脂质双层、GUV和哺乳动物细胞膜等膜模型中的形成表明了它们的结构稳健性、广泛适用性和膜适应性，为未来在纳米生物技术和医学领域的应用奠定了坚实基础。