肝硬化门脉高压患者肠道微生物群和代谢的变化：对疾病进展的影响

《Alimentary Pharmacology & Therapeutics》：Alterations in Gut Microbiota and Metabolism in Cirrhotic Portal Hypertension: Implications for Disease Progression

肠道菌群失调与门脉高压症进展的关联及机制研究。通过分析35例门脉高压症患者和71例对照的粪便微生物组及代谢组学数据，发现患者存在菌群多样性降低、产脂多糖菌增多及抗炎菌减少等特征，其代谢组学显示精氨酸代谢通路异常。动物实验证实，移植患者粪便菌群或特定致病菌（如 Veillonella nakazawae）可加剧小鼠门脉高压症，而抗生素干预可缓解病情。该研究揭示了肠道菌群通过调节宿主炎症反应和一氧化氮合成影响门脉高压症进展的潜在机制，为菌群靶向治疗提供新思路。

　　研究揭示了肠道菌群在肝硬化门脉高压（CPH）发生发展中的关键作用。CPH是一种重要的病理机制，能够引发多种肝硬化并发症，如腹水、食管胃底静脉曲张破裂出血以及肝性脑病，这些并发症是全球范围内导致死亡和肝移植的主要原因。尽管目前已有多种治疗手段，如病因治疗、血管扩张剂、非选择性β受体阻滞剂和经颈静脉肝内门体分流术，但治疗效果和预后仍然不尽如人意。因此，深入理解CPH的潜在机制对于开发更有效的治疗策略具有重要意义。

近年来，肠道菌群失调在多种肝脏疾病中的作用逐渐受到重视，包括肝炎、肝硬化、急性-on-慢性肝衰竭和肝细胞癌等。肝脏作为人体最大的代谢器官，其约三分之二的血液供应来自于门静脉，其中75%来自肠系膜静脉。这使得肝脏极易受到肠道微生物及其代谢产物的影响，从而提出了“肠道-肝脏轴”这一概念，用以强调这两个器官之间紧密的解剖和功能联系。越来越多的研究表明，肠道-肝脏轴可能在门脉高压的发生中起重要作用。例如，García-Lezana等人发现，在代谢性脂肪性肝炎的动物模型中，恢复健康的肠道菌群可以减轻门脉高压症状。Moghadamrad等人则指出，细菌定植诱导的肠道黏膜淋巴管和血流可能在门脉高压的形成中起到一定作用。然而，大多数研究集中在实验动物上，临床研究仍较为有限。

本研究旨在探讨肠道菌群及其代谢产物对CPH的影响。我们对CPH患者和非CPH患者（对照组）的粪便样本进行了整合的菌群和代谢组学分析，并识别了与CPH相关的菌群、粪便代谢物及功能通路。我们进一步通过粪便菌群移植（FMT）、CPH特征菌群移植以及抗菌实验，展示了肠道菌群在CPH进展中的重要作用。

在患者研究中，我们共招募了35名CPH患者和71名非肝硬化门脉高压（NC）患者。值得注意的是，所有参与者均检测出乙型肝炎表面抗原阳性。两组患者的临床特征总结于表1。结果显示，CPH患者与NC患者在年龄、性别和体重指数方面没有显著差异。CPH的诊断标准为通过影像学确认肝硬化并伴有食管或胃静脉曲张的患者。而NC组患者均为慢性乙型肝炎患者，正在接受抗病毒维持治疗或新启动治疗，且未出现肝硬化和静脉曲张。为了确保研究的准确性，我们设定了严格的排除标准，包括年龄大于70岁或小于20岁、合并肝或器官恶性肿瘤、慢性肾病、糖尿病、高血压或其他代谢疾病、严重内脏或感染性疾病、以及在粪便样本采集前一个月内接受过抗生素、二甲双胍、益生菌、质子泵抑制剂、类固醇或其他激素治疗的患者。所有患者信息均来源于问卷和医院电子病历。

在动物实验中，我们使用了健康的雄性ICR小鼠，体重18–22克，年龄4–6周。小鼠在正式实验前适应性饲养一周。实验小鼠被饲养在标准无特定病原体（SPF）条件下，保持65%湿度、23°C温度和12小时/12小时的光照周期，并可自由获取食物和水。为了构建CPH小鼠模型，我们采用腹腔注射10毫克/千克的N-二甲基亚硝胺（NDMN），每周连续注射三天，持续四周。此外，我们还构建了抗生素处理的小鼠模型，使用包含万古霉素（0.1克/升）、氨苄西林（0.2克/升）、甲硝唑（0.2克/升）和新霉素（0.2克/升）的广谱抗生素混合物，通过饮用水进行为期两周的治疗。我们收集了抗生素处理前后的小鼠粪便样本，并在哥伦比亚血琼脂平板上培养以确认菌群的耗竭。结果显示，小鼠粪便中的可培养菌群数量减少了超过90%，表明抗生素处理模型的成功建立。我们还通过α多样性（香农指数）、β多样性（Bray-Curtis距离）和微生物群落结构分析，评估了抗生素处理前后粪便菌群的变化。

我们对CPH和NC患者的粪便样本进行了16S rRNA测序和非靶向代谢组学分析（图S1）。结果显示，CPH患者的菌群多样性显著降低，这与NC患者相比，根据Chao1指数（p=0.036；图1A）具有统计学意义。香农指数的变化趋势相似，尽管未达到显著性（p=0.070；图1B）。通过主坐标分析（PCoA）评估微生物群落组成的变化，结果显示CPH与NC患者的肠道菌群结构存在显著差异（Adonis检验：p=0.001；图1C），这表明CPH患者存在肠道菌群失调。

在菌群水平上，我们发现CPH患者中变形菌门（Proteobacteria）的丰度显著增加，而拟杆菌门（Bacteroidetes）的丰度显著减少。此外，拟杆菌门与厚壁菌门（Firmicutes）的比例也显著上升。这些结果与我们的人群队列研究结果一致，表明CPH患者的肠道菌群结构发生了显著变化。我们还分析了所有菌群之间的共现网络，发现CPH组中具有显著统计学意义的菌群关联数量比NC组更多，这可能意味着CPH患者的肠道菌群相互作用更为紧密。

通过Wilcoxon秩和检验，我们确定了121种在两组之间显著不同的菌群（p<0.05；表S1）。我们构建了一个基于这些菌群的随机森林（RF）模型，用于区分CPH与NC患者，该模型的曲线下面积（AUC）达到了0.86（图S3）。RF模型进一步确定了与CPH最相关的10种菌群（按Gini指数减少量排序），其中包括丰度显著增加的菌群，如Flavonifractor、Veillonella、Klebsiella、Citrobacter、Clostridium和Streptococcus，以及丰度显著减少的菌群，如Adlercreutzia、Alloprevotella、Parasutterella和Coprococcus_2（图1G和图S4）。我们进一步分析了这些菌群与多个关键临床指标之间的相关性，发现Klebsiella、Veillonella和Streptococcus与肝功能指标（如总胆红素、凝血酶原时间、国际标准化比值、Child-Pugh评分和终末期肝病模型评分）以及门脉压力指标（如脾脏厚度和长度）存在显著正相关，这表明CPH表型可能与这些菌群在肠道菌群中的改变有关（图1H和表S3）。

为了进一步探索肠道菌群对CPH的潜在影响，我们分析了CPH患者粪便样本中的代谢物。使用气相色谱-飞行时间质谱（GC-TOF/MS）系统，我们检测到了40种在两组之间显著变化的代谢物（图2B–D和表S4–S6）。其中，17种代谢物在CPH患者中富集，而23种则减少（图2E和图S5）。KEGG通路富集分析显示，CPH患者中显著升高的代谢物主要影响氨基酸代谢通路，包括丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢；D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢；氮代谢；精氨酸生物合成以及精氨酸和脯氨酸代谢（图2F和表S7）。这些代谢通路之间存在相互作用，最终可能促进一氧化氮（NO）的合成（图2G）。这些发现表明，精氨酸生物合成通路的改变可能在CPH表型中发挥重要作用。

我们进一步分析了这些代谢物与特定菌群之间的关系。通过Procrustes分析，我们发现肠道菌群与代谢物之间存在显著的总体相关性（p=0.001；图3A）。我们还使用Spearman方法评估了差异菌群与代谢物之间的关联（表S13）。图3B展示了关键区分菌群与代谢物之间的复杂网络关系。一方面，肠道菌群的变化可能影响宿主的代谢，例如CPH富集的菌群与宿主的精氨酸代谢通路存在显著正相关。另一方面，代谢环境的变化可能为某些肠道菌群的生长提供能量支持。例如，某些肠道菌群能够表达硝酸盐还原酶（NIR），将宿主产生的硝酸盐还原为亚硝酸盐（图3C）。我们发现，CPH患者的粪便样本中硝酸盐和亚硝酸盐水平显著升高（p<0.001；图3D、E），表明CPH患者的肠道中存在更多能够表达NIR的菌群。我们进一步从CPH患者的粪便样本中分离出了两种目标菌株，Veillonella nakazawae和Streptococcus anginosus（图3F–H）。我们发现，随着培养基中硝酸盐含量的增加，这两种菌株的NIR活性也逐渐上升（图3I、J），表明它们能够将硝酸盐转化为亚硝酸盐，从而在厌氧环境中获得生长优势。因此，这两种菌株在含有硝酸盐的培养基中的生长速率也显著提高（图3K、L）。

我们还评估了抗生素干预对CPH小鼠模型的影响。首先，我们分析了正常小鼠与CPH模型小鼠之间肠道菌群组成的差异。PCoA分析显示，正常与模型组之间的肠道菌群结构存在显著差异（Adonis检验：p=0.002；图6B）。在门水平上，模型组中变形菌门的丰度显著低于正常组，而厚壁菌门/变形菌门比例显著升高（p<0.05；图6C、D），这与我们的人群队列研究结果一致。在属水平上，模型组与正常组之间存在显著差异的菌群，尽管与人群队列结果有所不同，但同样反映了CPH诱导的肠道菌群结构变化。

在抗生素干预后，我们通过腹腔注射NDMN诱导CPH。在第4周，抗生素干预组的门脉直径（PVD）和腹水深度（AD）均显著低于CPH模型组，而门脉血流速度（PVV）显著增加（p<0.05；图6I）。同时，与CPH模型组相比，抗生素干预组的脾脏重量显著减少，而血小板计数显著增加（p<0.05；图6J、K）。此外，与正常组相比，抗生素干预组的血流动力学变化无显著差异（p>0.05；图6I–K）。这些结果表明，肠道菌群的消除能够延缓CPH的进展。此外，抗生素干预显著降低了内毒素（LPS）水平（p=0.002；图6L）以及促炎性细胞因子（如IL-1β、IL-6和TNF-α）的水平（p<0.05；图6M–O）。iNOS和NO水平也显著降低（p<0.05；图6P、Q），表明抗生素治疗能够有效减轻炎症反应和NO的释放。

我们的研究发现，CPH患者的肠道菌群失调可能与门脉高压的进展密切相关。我们通过FMT实验验证了这一假设，发现CPH患者的肠道菌群移植能够显著促进门脉高压的发展。此外，我们还发现，特定的菌群，如Veillonella nakazawae，能够通过促进NO的合成，进一步加剧门脉高压的病理过程。这些结果表明，肠道菌群在CPH的发病机制中起着关键作用，并可能成为CPH治疗的新靶点。

本研究的局限性包括样本量较小、单中心研究以及未考虑环境因素、饮食摄入和药物使用等潜在混杂因素。尽管如此，我们的研究结果仍具有重要的临床意义。通过揭示肠道菌群在CPH中的作用，我们为未来的微生物组治疗策略提供了新的思路。例如，通过粪便菌群移植、益生菌干预和针对特定菌群的靶向药物，有望改善CPH的治疗效果。此外，我们还发现，肠道菌群的改变可能影响宿主的氨基酸代谢，从而间接影响NO的合成。这些发现不仅加深了我们对CPH发病机制的理解，也为开发新的治疗策略提供了理论依据。

综上所述，我们的研究首次直接揭示了肠道菌群在CPH发生发展中的重要作用。我们识别了与CPH相关的代谢通路，特别是精氨酸生物合成通路，这可能在调节炎症反应和血压方面发挥中介作用。本研究为CPH的微生物组治疗策略提供了新的视角，并可能成为未来临床研究的重要方向。然而，未来的研究需要进一步扩大样本量，采用多中心设计，并结合肝活检和门静脉压力梯度（HVPG）测量等方法，以验证我们的发现。此外，使用基于序列的宏基因组学而非16S rRNA扩增子测序，将有助于更全面地评估肠道菌群的功能和潜在作用。最后，我们还需考虑环境因素、饮食摄入和药物使用等潜在混杂因素，以确保研究结果的准确性和可靠性。