基于新型管式等离子体电离技术的癌细胞甾醇分析新方法

《ANALYTICAL AND BIOANALYTICAL CHEMISTRY》：Sterol analysis in cancer cells using atmospheric pressure ionization techniques

本研究针对甾醇生物合成途径分析中存在的浓度差异大、基质干扰强、离子抑制显著等难题，开发了一种新型LC-MS用管式等离子体电离(TPI)源，并与电喷雾电离(ESI)和大气压化学电离(APCI)技术进行了系统比较。结果表明，TPI在灵敏度方面与APCI相当，并显著优于ESI；在复杂生物基质（人血浆、HepG2细胞、肝组织）分析中，TPI表现出优异的信号稳定性和抗离子抑制能力，为甾醇精准定量提供了稳健可靠的新工具。

　　

在生命科学与医学研究领域，胆固醇及其生物合成途径中的各类甾醇分子不仅是细胞膜的关键组成部分，更被发现在癌症的发生发展中扮演着重要角色，有望成为癌症治疗的新靶点。然而，对这些甾醇分子进行精准定量分析却面临着巨大的技术挑战。一方面，甾醇生物合成途径中的前体分子与终产物胆固醇之间存在着巨大的浓度差异（从纳摩尔到毫摩尔级别），这要求分析方法具备极宽的动态范围；另一方面，甾醇分子结构相似，且在复杂的生物样本（如细胞、组织）中与大量基质成分共存，导致在质谱分析时产生强烈的离子抑制效应，严重影响定量的准确性和灵敏度。传统的液相色谱-质谱(LC-MS)技术，特别是常用的电喷雾电离(ESI)源，在处理此类高基质样本时往往力不从心。因此，开发和应用更高效、更稳健的电离技术，对于推动甾醇生物学功能研究和相关疾病诊疗具有重要意义。

为应对上述挑战，来自德国杜伊斯堡-埃森大学和应用分析化学领域的研究团队Pia Wittenhofer、Juan F. Ayala-Cabrera等人在《Analytical and Bioanalytical Chemistry》上发表了他们的最新研究成果。他们开发了一种新型的管式等离子体电离(TPI)源，用于LC-MS分析，并将其与两种成熟的大气压电离(API)技术——ESI和APCI，在甾醇分析性能上进行了全面、系统的比较评估。

研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：首先是心脏切割二维液相色谱(Heart-cutting 2D-LC)技术，用于有效分离结构相似的甾醇异构体并降低基质干扰；其次是三种大气压电离源（自主研发的TPI、商品化的APCI和AJS-ESI）的优化与比较，通过实验设计(DoE)优化关键参数；最后是严格的方法学验证，遵循国际人用药品注册技术协调会(ICH)指南，对线性范围、检出限(LOD)、定量限(LOQ)、离子抑制和信号稳定性等指标进行系统评价。所分析的生物样本包括商业化的人血浆、人肝癌细胞系HepG2细胞以及市售的牛肝组织，样本前处理采用液液萃取并结合水解步骤以同时测定游离和酯化甾醇。

电离行为和效率

研究首先考察了不同电离源下甾醇的离子化行为。典型甾醇如T-MAS，在ESI中会形成多种加合离子（如[M+H]⁺、[M+NH₄]⁺和[M+H-H₂O]⁺），导致信号分散。而APCI和TPI则主要生成脱水离子[M+H-H₂O]⁺，更有利于定量分析。碰撞诱导解离后，各离子源均产生特征碎片离子（如m/z 95），表明 fragmentation 模式一致。

信号稳定性

在长达26小时、共40次进样的连续分析中，APCI和TPI表现出卓越的信号稳定性，胆固醇与其氘代内标峰面积的比值波动很小。相比之下，ESI的信号则呈现明显的不稳定性，尤其在分析肝组织等高基质样本时。

离子抑制

通过T型三通在色谱柱后加入内标来评估离子抑制效应。结果显示，在高浓度胆固醇和基质共流出的时间段，ESI遭受了严重的离子 suppression，信号显著降低。而APCI和TPI则表现出很强的抗干扰能力，信号保持稳定，其中APCI最为稳健。

基于ICH指南的方法表征

对14种甾醇及相关分子进行了系统方法学验证。APCI和TPI的灵敏度（以LOD和LOQ衡量）显著优于ESI。APCI的中位LOD为10 nmol/L，TPI为30 nmol/L，而ESI为1000 nmol/L。APCI和TPI的线性范围（上限LOQ可达60,000-90,000 nmol/L）也远宽于ESI。对于高浓度的胆固醇，通过优化条件，APCI和TPI的定量上限可达9 mmol/L，满足了生物样本中宽浓度范围测定的需求。

实际样本应用

将三种电离源应用于人血浆、HepG2细胞和牛肝组织的甾醇分析。结果表明，对于大多数甾醇，APCI和TPI的定量结果高度一致。由于ESI的灵敏度低和离子抑制强，许多低丰度的甾醇生物合成中间体（如zymosterol）无法被可靠定量，而APCI和TPI则能成功检测并定量。在HepG2细胞中，对lanosterol、desmosterol、cholesterol等含量较高的甾醇，APCI和TPI结果吻合良好，标准偏差小，证明了方法的可靠性和重复性。

本研究成功开发并验证了一种用于LC-MS的新型TPI电离源，并将其应用于具有挑战性的癌细胞甾醇分析。与广泛使用的ESI和APCI相比，TPI展现出与APCI相媲美甚至更优的分析性能。其在灵敏度上明显超越ESI，在抗离子抑制能力和信号长期稳定性方面与APCI同样出色，并且在复杂生物基质（人血浆、HepG2细胞、肝组织）中获得了与APCI高度一致的定量结果。这些发现表明，TPI作为一种新兴的电离技术，特别适用于甾醇等低极性至中等极性化合物的稳健、高灵敏度定量分析，为解决甾醇生物合成研究中的分析难题提供了强有力的工具。值得注意的是，本研究中所用的TPI源仍为实验室自制原型机，其性能已接近成熟的商品化APCI源，预示着其未来在分析化学和生命科学领域具有广阔的应用前景。