新一代蛋白质测序与单离子质谱技术互补分析白细胞介素-6的突破性研究

《ANALYTICAL AND BIOANALYTICAL CHEMISTRY》：Next-generation protein sequencing and individual ion mass spectrometry enable complementary analysis of interleukin-6

本研究针对蛋白质组复杂性超越单一分析技术的问题，研究人员通过整合单分子蛋白质测序（NGPS）和单离子质谱（I2MS）技术，对重组人IL-6进行了多层级分析。结果表明，两种技术可实现52%的序列覆盖度，显著提升了对IL-6结构与功能关键区域的分析能力，为蛋白质 therapeutics 的开发提供了更全面的表征方案。

　　

在生命科学和生物医药领域，蛋白质作为细胞功能的核心执行者，其结构的精确解析直接关系到疾病机制理解和药物开发效率。然而，蛋白质在生物体内往往以多种变体形式存在，这些变体由基因变异、选择性剪接、蛋白酶解和多种翻译后修饰共同塑造，形成复杂的蛋白质变体谱。传统的蛋白质分析技术，如完整质量分析和多属性方法，虽然在生物制药领域取得显著成效，但在覆盖度、灵敏度和质量范围方面存在局限，难以全面捕捉蛋白质变体的多样性。

以白细胞介素-6（IL-6）为例，这种细胞因子在免疫调节中扮演关键角色，其重组形式被广泛应用于治疗领域。IL-6通过形成四螺旋束结构，与IL-6受体α和gp130受体结合介导信号转导。研究表明，IL-6的螺旋区和环区存在多个与受体结合相关的关键残基，同时其糖基化等修饰会直接影响生物活性和稳定性。因此，全面覆盖IL-6的氨基酸序列和修饰信息对于优化其治疗应用至关重要。

为突破现有技术瓶颈，研究人员在《Analytical and Bioanalytical Chemistry》上发表了最新成果，首次将两种前沿技术——新一代蛋白质测序（NGPS）和单离子质谱（I²MS）——进行整合，对重组人IL-6（rhIL-6）在氨基酸、肽段和完整蛋白质变体水平进行了互补分析。

研究采用的关键技术方法主要包括：1）基于Quantum-Si公司Platinum仪器的单分子蛋白质测序技术，通过N末端氨基酸识别器结合和氨肽酶切割循环实现对Lys-C酶切肽段的并行测序；2）基于Orbitrap的多重电荷检测质谱平台I²MS，直接测量单个蛋白质变体离子的完整质量，并通过I²MS²进行气相碎片分析；3）使用SampleStream平台实现自动化样本处理，样本来源为HEK293表达的重组人IL-6（AcroBiosystems）。

NGPS对IL-6的测序结果

Platinum平台通过六个荧光标记的N末端氨基酸识别器靶向13种氨基酸，产生具有单氨基酸分辨率的识别段。测序数据显示，NGPS成功覆盖了IL-6的五个关键肽段，包括螺旋A和C内的区域，这些区域含有影响IL-6功能的残基。例如，肽段V₁₂₀LIQFLQK₁₂₇的FDR（错误发现率）为0.0，表明即使面对连续同量异位残基（如亮氨酸和异亮氨酸），识别器也能通过脉冲持续时间差异实现准确区分。NGPS最终在IL-6中实现了25%的氨基酸级别覆盖度，并通过蛋白质推断分析以99.99%的置信度确认了IL-6的身份。

I2MS对完整蛋白质变体的分析

I2MS技术成功检测到未修饰的IL-6（约20.8 kDa）及其多个高质量蛋白质变体（最高约22 kDa），这些变体与HEK293表达系统中预期的糖基化修饰一致。通过搜索GlyGen数据库，研究人员推测这些变体含有O-糖基化修饰，并利用I2MS²对选定变体进行碎片分析，将O-糖基化定位于螺旋D附近的苏氨酸残基（如T147、T166和T177）。I2MS²实现了39%的序列覆盖度，覆盖了NGPS未检测到的疏水区域（如螺旋B内的内部片段）和亲水环区。

技术互补性与功能区域覆盖

NGPS和I2MS在多个关键区域展现出互补性：例如，在螺旋A的Q₂₇IRYILDGISAL₃₈区域，NGPS提供了11/12个氨基酸的单残基分辨率，而I2MS²则填补了甘氨酸残基的检测空白；在含有半胱氨酸的区域，I2MS²检测到NGPS因缺乏相应识别器而无法覆盖的片段。通过整合两种技术，总序列覆盖度达到52%，覆盖了IL-6中与受体结合、信号转导和剪切变体相关的关键区域。

结论与意义

本研究首次证明NGPS和I2MS技术的联合应用能够显著提升对IL-6等重要细胞因子的分析深度。NGPS在单氨基酸分辨率下覆盖了多个功能关键肽段，而I2MS则提供了完整蛋白质变体质量和修饰信息。这种互补策略不仅为IL-6的生物学功能和治疗优化提供了更全面的视角，也为未来复杂样本（如免疫沉淀物或组织提取物）的蛋白质分析奠定了基础。尽管当前研究聚焦于重组蛋白，但该方法的扩展应用将有助于揭示内源性蛋白质变体在疾病发生和发展中的作用，推动精准医疗和生物制药质量的进一步提升。