无脊椎动物衍生DNA条形码（iDNA）在西苏门答腊吸血水蛭中的应用：发现了蓝眼林蛙Leptobrachium waysapuntiense

《Ecology and Evolution》：Application of Invertebrate-Derived DNA Barcoding (iDNA) in Blood Sucking Leeches From West Sumatra: A Discovery of Blue-Eyed Litter Frog Leptobrachium waysapuntiense

本研究利用iDNA技术分析印尼苏门答腊西部272只吸血蝾螈样本，成功检测到17种脊椎动物宿主，包括首次通过iDNA发现的稀有蓝眼蝾螈Leptobrachium waysepuntiense。结果显示，16Sed和12S基因标记能有效检测哺乳类和两栖类，而ND2和COI在本次研究中未捕获鸟类和鱼类。方法采用多基因靶向Sanger测序，结合地理信息排除误判。研究证实iDNA可作为补充传统监测手段，提升小体型物种检测效率，对保护区内濒危物种监测具有重要应用价值。

　　印尼是全球生物多样性最丰富的国家之一，拥有大量的脊椎动物和植物物种。然而，在热带雨林中评估生物多样性仍然面临诸多挑战。传统的工具和方法常用于监测和研究目的，而无侵入性技术如“无脊椎动物衍生DNA”（iDNA）则为生物多样性评估提供了新的补充手段。iDNA作为环境DNA（eDNA）的一个分支，通过分子方法检测脊椎动物物种并监测其种群动态，能够以非破坏性方式获取重要的生态数据。特别是在印尼的热带雨林地区，利用大量吸血的水蛭进行采样，可以更广泛地覆盖区域内的宿主物种。这些水蛭的肠道中能够长期保留高质量的宿主DNA，为iDNA研究提供了可靠的样本来源。

在本研究中，研究人员使用了五组引物（16Scp、16Sed、12S、ND2和RepCOI）进行Sanger测序，对272个水蛭样本进行了分析，最终成功鉴定了17种独特的脊椎动物宿主，包括哺乳动物、两栖动物和爬行动物。在这些样本中，16Sed引物组的检测范围超出了最初设计的分类群，不仅涵盖了哺乳动物，还能够识别爬行动物，从而提升了物种多样性的检测能力。值得注意的是，本研究首次通过iDNA技术发现了在西苏门答腊地区罕见的蓝眼小蛙（Leptobrachium waysepuntiense），这表明iDNA技术在识别稀有物种方面具有独特的优势。

印尼的生物多样性正受到多种威胁，其中森林砍伐是最严重的问题之一。自1950年至2017年，印尼的初级森林流失率位居全球前列，导致许多物种面临灭绝的风险。特别是在小型脊椎动物中，如两栖动物，由于其体重阈值较低（0.039千克），灭绝风险显著上升。此外，非法捕猎、野生动物贸易以及气候变化也加剧了这一趋势。为了应对这些挑战，印尼的科研人员已经开展了多项实地研究，以监测和防止生物多样性的下降。然而，传统的监测方法，如相机陷阱和直接观察，虽然能够提供关于物种组成和种群动态的重要信息，但存在成本高、易被盗以及数据处理耗时等缺点。对于小型哺乳动物，这些方法的检测效率较低，难以有效识别和记录它们的分布情况。

iDNA作为一种新兴的生物多样性评估方法，具有较高的灵敏度、成本效益和操作效率。它能够通过检测吸血无脊椎动物（如水蛭）的肠道内容物中的宿主DNA，识别出多种脊椎动物。这种方法特别适用于难以直接观察或追踪的物种，例如栖息于复杂森林环境中的两栖动物和小型哺乳动物。在印尼，水蛭被认为是研究iDNA的合适宿主，因为它们的栖息地与许多脊椎动物重叠，且能够长期保留宿主DNA。尽管iDNA在评估两栖动物方面仍处于初步探索阶段，但已有研究显示，它在识别稀有物种方面具有巨大潜力。

在本研究中，研究人员对西苏门答腊地区的水蛭样本进行了广泛的采集，并利用Sanger测序技术对不同基因区域进行了分析。采集区域涵盖了从低地森林（海拔231米）到高山地区（海拔2127米）的多种生境，包括自然保护区、生物教育与研究森林以及野生动物保护区。这些水蛭样本的采集过程采用了非侵入性方式，避免了对宿主动物的直接干扰。通过DNA提取和测序，研究人员成功鉴定了多种脊椎动物，包括哺乳动物、两栖动物和爬行动物。其中，16Sed引物组在识别物种方面表现出色，能够覆盖更广泛的分类群，包括哺乳动物和爬行动物。此外，本研究还首次通过iDNA方法记录了蓝眼小蛙（Leptobrachium waysepuntiense）在西苏门答腊地区的分布，为该物种的保护提供了新的数据支持。

在对水蛭DNA进行分析时，研究人员采用了多种基因标记，包括16S rRNA、12S rRNA、ND2和COI等。这些基因标记在不同的分类群中具有不同的适用性，例如16Sed引物组最初设计用于两栖动物和硬骨鱼类，但在本研究中却成功识别了哺乳动物。这表明，iDNA方法在实际应用中可能具有更广泛的适用性，能够覆盖更多样化的物种。此外，不同基因标记的检测结果在分类精度上存在差异，部分引物组只能识别到科或属的水平，而另一些则能够达到种的识别。为了确保数据的准确性，研究人员采用了严格的相似度阈值（98%）和期望值（E-value）标准（小于10^-30），以避免低质量匹配。

在对蓝眼小蛙（Leptobrachium waysepuntiense）的系统发育分析中，研究人员发现该物种的DNA序列与已知的其他蓝眼小蛙物种（如Leptobrachium montanum）之间存在较近的遗传距离，这进一步支持了其分类地位。此外，分析还揭示了该物种与其他两栖动物之间的进化关系，表明其在分类学上具有独特的地位。这些发现不仅为蓝眼小蛙的分布和保护提供了新的证据，也强调了iDNA技术在识别稀有和濒危物种方面的价值。

尽管iDNA技术在生物多样性监测中展现出巨大潜力，但其在实际应用中仍面临一些挑战。例如，部分基因标记未能检测到预期的分类群，如鸟类和鱼类。这可能与引物的特异性、样本的获取方式以及环境因素有关。此外，部分检测结果在地理上不具合理性，这可能源于实验室污染或数据库的不完整性。因此，在使用iDNA方法时，需要结合其他传统方法，以提高检测的准确性和可靠性。

本研究的发现表明，iDNA方法可以作为印尼生物多样性监测的重要补充手段。通过分析水蛭的肠道内容物，研究人员能够识别出多种稀有和濒危物种，如苏门答腊虎（Panthera tigris sumatrae）和苏门答腊麂（Capricornis sumatraensis）。这些结果不仅有助于了解这些物种的分布情况，也为制定有效的保护措施提供了科学依据。例如，通过iDNA方法可以识别出哪些区域存在高风险的野生动物与人类活动冲突，从而为当地社区和保护机构提供针对性的干预建议。

此外，本研究还强调了iDNA方法在印尼热带雨林中的适用性。由于印尼的生物多样性研究相对滞后，且许多物种尚未被充分记录，iDNA技术能够提供一种低成本、高效且非侵入性的监测手段。特别是在一些难以进入的地区，水蛭作为宿主可以提供重要的生态信息。然而，需要注意的是，iDNA方法仍存在一定的局限性，例如检测结果可能受到引物特异性、样本数量和环境因素的影响。因此，未来的研究需要进一步优化引物设计，提高检测精度，并结合其他方法，以确保数据的全面性和准确性。

总体而言，本研究通过iDNA技术成功识别了多种脊椎动物，包括稀有和濒危物种，展示了该方法在生物多样性监测中的广泛应用前景。随着技术的不断进步和数据库的完善，iDNA有望成为印尼及其他热带地区生物多样性保护的重要工具。同时，本研究也指出了iDNA方法在实际应用中需要注意的问题，例如实验室污染、引物效率和分类学上的不确定性。未来的研究应进一步探索iDNA技术的优化和标准化，以提高其在生物多样性监测中的可靠性和适用性。