将DNA甲基化谱分析作为儿童中枢神经系统肿瘤分子分类工具的应用：一项基于中等收入国家人群的研究

DNA甲基化分型在巴西儿童中枢神经系统肿瘤诊断中的应用及资源有限地区的可行性研究，显示甲基化分析可纠正或细化82.8%的初始诊断，尤其在罕见亚型识别中效果显著，为全球尤其是中低收入国家提供了重要分子诊断资源。

　　
本研究以巴西坎皮纳斯一家儿童肿瘤专科中心为样本，针对182例儿童中枢神经系统肿瘤（CNS）进行DNA甲基化 profiling分析，旨在验证甲基化技术在资源有限地区的诊断价值，并为国际分子数据库补充中低收入国家（LMICs）的数据。研究采用Illumina MethylationEPIC BeadChip芯片结合DKFZ/Heidelberg分类器（v12.8），通过多组学技术（WES、RNA-seq、ddPCR）验证分子分型，最终将样本分为控制组（19例）和可分析组（163例）。以下为研究核心内容的解读：

### 一、研究背景与意义
儿童CNS肿瘤占所有儿童癌症的20%-30%，其中恶性程度较高的胚胎性肿瘤、间变性星形细胞瘤等亚型诊断依赖病理学特征，但存在20%-30%的误诊率。传统诊断受限于样本质量、病理技术差异及罕见亚型识别困难。甲基化 profiling作为表观遗传学标记，能通过检测全基因组DNA甲基化水平，弥补传统病理诊断的不足。然而，LMICs因设备、技术和资金限制，鲜有大规模甲基化研究，导致国际数据库中此类人群数据匮乏。本研究通过巴西本土病例验证甲基化分型可行性，同时为全球CNS肿瘤分子分类提供巴西人群数据支持。

### 二、研究方法与技术创新
#### 1. 样本纳入与排除标准
纳入标准：确诊为CNS原发肿瘤，年龄≤21岁，提供冷冻组织样本（用于甲基化分析）及FFPE样本（用于病理诊断）。排除标准包括转移性肿瘤、样本降解（RNA完整性<5星）或无法通过伦理审查（如儿童未达知情同意年龄）。研究覆盖2000-2003年及2019-2023年两批病例，确保样本多样性。

#### 2. 甲基化分型技术流程
采用Illumina MethylationEPIC芯片（850K beadset），经Bisulfite转化后进行 bead hybridization，NextSeq 550测序平台读取数据。质量控制包括：
- **QC1**：通过FastQC检测测序质量（序列完整性≥90%）
- **QC2**：用minfi R包评估B值分布（>0.1%异常样本剔除）
- **QC3**：使用t-SNE可视化（降维至100个变量，聚类系数Kappa=0.87）

分类阈值设定为：甲基化家族评分≥0.9，亚型评分≥0.5。对于评分<0.5的样本，采用多组学验证（WES、RNA-seq、IHC）。

#### 3. 多组学验证体系
- **WES**：覆盖84%外显子，过滤DP<10的位点，通过InterVar（ACMG v5.28）进行突变注释
- **RNA-seq**：使用TruSeq stranded library，STAR-Fusion检测融合基因（置信度>90%）
- **ddPCR**：针对H3K27me3突变（CDS:NM_000060.5:c.3541G>A）设计LNA探针，MAF阈值设为0.01
- **IHC**：采用DAB显色技术，检测GFAP（敏感性92%）、H3K27me3（特异性88%）等关键标记

### 三、核心研究发现
#### 1. 甲基化分型总体效能
- **分类成功率**：163例可分析样本中，135例（82.8%）获得高信度分型（C-score≥0.9）
- **诊断修正率**：28例（20.9%）分型修正原病理诊断，包括：
- 9例（5.5%）原病理诊断错误（如CNS_192将 choroid plexus carcinoma误诊为AT/RT）
- 19例（11.5%）补充亚型信息（如PFA-1A、ZFTA::RELA等）

#### 2. 诊断修正的关键案例
- **案例1（CNS_192）**：
- 原病理： choroid plexus carcinoma
- 甲基化分型：AT/RT（SHH激活型）
- 验证：SMARCB1基因缺失（-21q13.3）、INI1阴性（IHC）
- **案例2（CNS_156）**：
- 原病理：CNS embryonal tumour
- 甲基化分型：Diffuse paediatric-type high-grade glioma (MYCN型)
- 验证：8q24.3 duplication（MYCN扩增）、ATRX缺失

#### 3. 分型与临床特征关联
- **Pilocytic astrocytoma**：
- 35例中，31例（88.6%）保持基因组稳定性（CN flat）
- 4例（11.4%）出现5p13.1（BRAF） duplication（预后不良标志）
- **Medulloblastoma**：
- 28例（31.8%）中，SHH激活型（14例）与WNT激活型（14例）分别对应低/高复发风险
- Group 3/4亚型中，9例（32.4%）出现CNS播散（CTC≥3个脑叶）
- **Ependymoma**：
- PFA亚型（12例）与ZFTA::RELA融合（5例）均存在1q21.3扩增
- 6例（37.5%）出现6q22.1缺失（预后不良指标）

#### 4. LMICs特有的技术挑战
- **样本制备**：32%病例因FFPE包埋时间过长（>5年）导致DNA降解（B值中位数1.24 vs 正常1.78）
- **技术经济性**：单例成本$150（含WES），但通过冷冻样本存储策略，年样本量提升300%
- **生物信息学瓶颈**：本地服务器处理100例样本需72小时（HICs平均24小时）

### 四、临床转化价值
1. **诊断优化**：
- 罕见亚型识别：DGONC（3例）、ZFTA::RELA融合型（5例）、YAP1融合型（2例）
- 误诊修正：11例CNS embryonal tumours重新分型为具有明确分子分型的肿瘤（如PB-FOXR2型）
2. **治疗指导**：
- MYCN扩增型（CNS_156）需考虑强化放疗
- SHH激活型（CNS_192）优先选择 Hedgehog通路抑制剂
- H3K27mutant型（CNS_019）纳入Nestor研究试验队列
3. **经济性评估**：
- 单次甲基化分型成本较WES降低60%（$75 vs $200）
- 诊断修正后治疗费用平均节省$8,200/例（基于巴西医保数据）

### 五、研究局限性
- **样本代表性**：纳入病例中75%为低级别胶质瘤，高级别肿瘤样本量不足（仅8例）
- **技术差异**：本地实验室的ddPCR检测MAF（0.01-0.73）与HICs（0.005-0.85）存在±15%偏差
- **长期预后数据缺失**：仅32例完成5年随访，需更大队列验证

### 六、对全球医学界的意义
1. **数据库建设**：
- 补充巴西人群数据（西 hemisphere为主，与GEO数据库对比差异度达18.7%）
- 建立LMICs特有的甲基化参考数据库（已上传至Bgee v4.5）
2. **技术标准化**：
- 提出甲基化分型在LMICs的优化流程（样本筛选→快速质控→本地化分析）
- 制定甲基化芯片在发展中国家成本优化方案（批量检测降低单价40%）
3. **临床实践影响**：
- 将甲基化分型纳入巴西国家癌症中心（CONACOMP）指南（2025版）
- 推动巴西本土制药企业（如Natura）开发针对SHH/MYC通路的靶向药物

### 七、未来研究方向
1. **技术迭代**：
- 开发基于EdgeR的本地化甲基化分析工具（预计2026年上线）
- 探索甲基化分型与影像组学的联合诊断模型（目前验证中）
2. **临床验证**：
- 计划在3家LMICs中心开展多中心研究（样本量目标：1200例）
- 建立甲基化分型与生存率的预后模型（当前AUC=0.89）
3. **政策建议**：
- 推动WHO将甲基化分型纳入CNS肿瘤诊断标准（2027年评估周期）
- 建议巴西政府将甲基化检测纳入国家医保目录（预计节省年度医疗支出$2.3亿）

本研究首次在巴西人群验证甲基化分型的临床适用性，其成果已通过巴西国家癌症研究所（INCA）认证，并作为证据提交至WHO/IARC的神经肿瘤分类修订委员会。相关技术手册（含本地化参数）已由CAPES资助翻译成葡萄牙语，计划在2025年第二季度发布。