CRISPR/Cas9辅助的微型机器人用于快速且超灵敏的“即时”下一代DNA检测

《Advanced Functional Materials》：CRISPR/Cas9-Assisted Microrobots for Fast and Ultrasensitive “On-The-Fly” Next-Generation DNA Detection

DNA快速检测：CRISPR/Cas9金微机器人自驱动传感系统研究

　　本研究介绍了一种新型的基于CRISPR/Cas9的微机器人生物传感器，该传感器利用了金基微机器人（Au–MRs）的自推进特性，以实现对目标DNA的快速、高灵敏度和高选择性的检测。这项技术的出现，不仅为临床诊断、食品安全和环境监测等应用提供了新的可能性，也为生物传感领域带来了突破性的进展。

在现代生物技术中，CRISPR/Cas系统因其高度的精准性和多功能性而备受关注。该系统最初在1980年代被发现于大肠杆菌中，作为一种古老的防御机制来抵御噬菌体。随后，CRISPR/Cas9作为基因编辑工具被广泛应用，包括转录调控、表观遗传学研究以及生物传感等。Cas蛋白在引导RNA（gRNA）的协助下，可以高效地识别并切割特定的DNA或RNA序列，从而改变其生物学功能。基于这一特性，CRISPR/Cas9已被用于多种生物传感平台，通过标记的核酸在被切割后释放出可检测信号，从而实现对目标分子的识别。

然而，传统CRISPR/Cas9生物传感器在复杂生物样本中的应用仍面临一些挑战。例如，依赖于荧光单链DNA探针的系统通常表现出较低的稳定性和灵敏度，尤其是在生物体液中。此外，一些方法需要繁琐的样本预处理步骤，增加了检测的复杂性和时间成本。为了解决这些问题，研究者们开始探索将CRISPR/Cas9与纳米材料结合，以提升其性能。其中，金基纳米材料因其优异的化学稳定性、高消光系数、良好的生物相容性以及可调节的光学和电化学性质，成为一种极具潜力的材料。这些特性使得金纳米材料在信号增强、信号放大和减少背景噪声方面表现出色，从而显著提高了检测的准确性。

本研究提出了一种创新的解决方案，即通过将CRISPR/Cas9功能化到金基微机器人（Au–MRs）上，构建了一种“运动增强型”的生物传感器。这种微机器人基于双金属结构，由外层的金和内层的铂组成。铂作为催化剂，能够在氢过氧化物（H?O?）的分解过程中产生氧气气泡，从而推动微机器人自主运动。这种自推进机制不仅提高了微机器人在复杂环境中的运动能力，还增强了其与目标DNA的动态交互，进而提高了检测的效率和灵敏度。

在实验中，研究人员首先对Au–MRs进行了物理化学表征，包括扫描电子显微镜（SEM）和能量色散X射线光谱（EDS）分析。SEM图像显示，Au–MRs具有管状结构，平均长度约为10微米，这种结构有利于气泡的生成和定向推进。EDS分析则验证了Au和Pt在微机器人表面的均匀分布，表明其结构和功能的完整性。此外，通过荧光光谱分析，研究人员评估了Au–MRs在不同条件下的光学性能，确认其荧光信号在与FAM探针结合后被有效淬灭，而在CRISPR/Cas9切割双链DNA后能够恢复，从而形成可检测的信号。

为了进一步优化检测性能，研究团队对Cas9的浓度和作用时间进行了系统研究。实验结果表明，当Cas9浓度为50纳摩尔时，能够实现最佳的信号增强效果，而作用时间控制在6分钟内，即可完成高效的DNA切割和信号恢复。同时，研究人员还评估了不同浓度的H?O?对微机器人运动和CRISPR/Cas9活性的影响。结果显示，0.5%的H?O?浓度能够在保证微机器人高效运动的同时，维持CRISPR/Cas9的稳定性和活性。而更高浓度的H?O?则可能导致气泡过多，影响DNA与微机器人之间的有效接触，并可能通过氧化作用干扰Cas9的结构和功能。

在检测性能方面，该平台在目标DNA浓度范围从4飞摩尔（fM）到400纳摩尔（nM）内均表现出优异的灵敏度和动态范围。相较于其他CRISPR/Cas9生物传感器，该系统能够在5分钟内完成检测，显著提高了检测速度。这种快速响应能力，得益于微机器人在检测过程中持续的运动，使得目标DNA能够与CRISPR/Cas9复合物进行多次高效接触，从而实现信号的放大。同时，该系统在不同生物样本（如人血浆和尿液）中的检测性能也得到了验证，虽然在血浆中的信号回收率略低于尿液，但仍然保持了良好的稳定性和可靠性。这些结果表明，该平台在实际应用中具有较高的可行性。

此外，该生物传感器在复杂生物环境中的表现也显示出其优越的特异性。通过比较目标DNA、错配DNA和非互补DNA的荧光响应，研究团队发现该系统能够有效区分不同的DNA序列，显示出对目标DNA的高度识别能力。这使得该传感器在需要高特异性检测的应用中，如遗传病筛查、食品安全检测和环境监测等方面，具有重要的应用价值。

从整体来看，本研究提出的CRISPR/Cas9@Au–MRs生物传感器不仅克服了传统方法在速度、灵敏度和操作复杂性方面的不足，还通过金基微机器人的自推进特性，实现了“实时”和“动态”的DNA检测。这一技术的创新性在于将生物识别能力与微机器人运动相结合，从而在不依赖复杂样本处理的情况下，实现快速、高效和高灵敏度的检测。同时，该平台具备良好的可扩展性和成本效益，适合在临床诊断、生物安全和环境监测等场景中广泛应用。

在实验方法方面，研究人员采用了一系列先进的表征技术，包括SEM-EDX用于表面形态和元素分布分析，Zeta电位分析用于评估微机器人的表面电荷变化，以及荧光光谱用于检测信号的变化。这些方法不仅确保了微机器人结构和功能的稳定性，还为优化其性能提供了科学依据。同时，实验中使用了多种生物样本，验证了该平台在实际环境中的适用性，为进一步推广和应用奠定了基础。

综上所述，这项研究为CRISPR/Cas9在生物传感领域的应用提供了新的思路和方法。通过将CRISPR/Cas9与金基微机器人相结合，该系统不仅实现了快速、高灵敏度的DNA检测，还展现了良好的特异性、稳定性和可扩展性。这些特性使其成为未来DNA检测技术的重要发展方向，有望在医疗健康、食品安全和环境保护等领域发挥重要作用。未来的研究可以进一步探索该平台的循环使用能力，以及在更多复杂生物样本中的适应性，以推动其在实际应用中的普及和优化。