通过自放大质子生成技术构建人工线粒体，以实现人工细胞中的自主能量供应和代谢耦合

《ANGEWANDTE CHEMIE-INTERNATIONAL EDITION》：Engineering Artificial Mitochondria with Self-Amplifying Proton Generation for Autonomous Energy Supply and Metabolic Coupling in Artificial Cells

人工线粒体构建及能量代谢模拟研究。通过共封装葡萄糖氧化酶（GOx）和过氧化氢酶（CAT）于二氧化硅纳米胶囊，形成自增强的质子梯度系统，驱动ATP酶高效合成ATP。纳米胶囊的封闭环境促进酶协同作用，快速分解GOx产生的H2O2，维持稳定的质子梯度（ΔpH≈1.4）。整合至人工细胞（GUVs）后，该系统实现葡萄糖向ATP的持续转化，并支持NADH的ATP依赖性合成，模拟天然氧化磷酸化过程。该平台为构建自主能源系统提供了新策略。

　　在自然界中，细胞的生存依赖于一系列复杂的生物化学反应，其中能量的持续供应是维持生命活动的关键。人工细胞作为合成生物学领域的重要研究方向，旨在通过自下而上的方法构建具有类似细胞功能的系统。然而，要实现人工细胞的自主能量供应，尤其是模拟线粒体的能量转换过程，仍然是一个巨大的挑战。线粒体是细胞内主要的ATP生成器，通过氧化磷酸化过程产生ATP，这一过程依赖于膜两侧的质子梯度。因此，构建一个能够稳定维持质子梯度的人工线粒体系统，是实现人工细胞能量自给自足的重要一步。

本研究提出了一种模拟线粒体功能的ATP纳米生成器，其核心在于通过定量共封装葡萄糖氧化酶（GOx）和过氧化氢酶（CAT）于二氧化硅纳米胶囊中，构建出一种高效的酶促反应系统。这种纳米胶囊不仅能够保护酶免受外界环境的影响，还能通过其内部的微环境促进酶之间的协同作用。GOx和CAT在纳米胶囊内的共封装，形成了一种自增强的酶级联反应：GOx将葡萄糖氧化为葡萄糖酸，同时产生过氧化氢（H?O?），而CAT则迅速将H?O?分解为氧气（O?），这一过程不仅减少了H?O?的毒性，还进一步促进了GOx的反应效率，从而增强了质子的生成能力。通过这种方式，系统能够持续地产生质子，并在膜两侧形成稳定的质子梯度，进而驱动ATP合成酶的旋转，实现高效的ATP生成。

为了构建完整的人工线粒体系统，研究人员将封装了GOx和CAT的二氧化硅纳米胶囊与整合了ATP酶的脂质双分子层结合，最终形成了一种人工线粒体结构（GC@SiO?@Lips-ATPase）。这种结构不仅模拟了线粒体的膜系统，还通过脂质双分子层的构建实现了ATP酶的稳定整合。ATP酶的整合使得系统能够在纳米胶囊产生的质子梯度作用下，高效地合成ATP。此外，研究人员还进一步将这一人工线粒体系统整合到巨单层囊泡（GUVs）中，构建出一个完整的人工细胞模型。在这个模型中，葡萄糖被GOx氧化，产生的质子梯度驱动ATP合成，而ATP又为NADH的生物合成提供能量支持。这种系统不仅模拟了线粒体的能量转换过程，还实现了类似细胞内的代谢耦合，为构建具有自主代谢能力的人工细胞提供了新的思路。

在实验过程中，研究人员采用了多种方法来验证这一系统的性能。首先，通过动态光散射（DLS）和透射电子显微镜（TEM）分析，确认了纳米胶囊的尺寸和形态一致性。其次，利用荧光共聚焦显微镜（CLSM）观察了酶在纳米胶囊中的共定位情况，进一步证明了GOx和CAT的协同作用。此外，通过比较不同组的酶活性、氧气和过氧化氢的浓度变化，研究人员评估了系统在不同条件下的性能表现。结果显示，共封装GOx和CAT的纳米胶囊（GC@SiO?）相较于单独封装GOx或CAT的系统，能够显著提升质子生成能力，并减少H?O?的积累，从而提高系统的稳定性和效率。

进一步的实验表明，GC@SiO?@Lips-ATPase系统能够产生稳定的质子梯度，这一梯度不仅促进了ATP的高效合成，还为NADH的生成提供了必要的能量支持。在GUV中，NADH的生成过程通过一系列酶促反应实现，包括葡萄糖的磷酸化（由己糖激酶催化）和葡萄糖-6-磷酸的氧化（由葡萄糖-6-磷酸脱氢酶催化），这些反应共同作用，将葡萄糖转化为NADH。通过实验比较，研究人员发现，当GC@SiO?@Lips-ATPase与NADH生成路径共同封装于GUV中时，NADH的生成量显著增加，这表明人工线粒体与代谢路径的整合能够有效提升人工细胞的能量转化效率。

这一系统的成功构建，不仅克服了传统人工线粒体在酶稳定性、H?O?毒性以及能量转换效率等方面的瓶颈，还为未来构建更加复杂和功能完善的人工细胞提供了基础。通过模拟线粒体的能量转换机制，研究人员实现了人工细胞的自主能量供应，并使其具备类似细胞的代谢能力。这种人工细胞系统能够持续地从葡萄糖中提取能量，转化为ATP，进而驱动其他代谢反应，如NADH的生成，从而在一定程度上模拟了自然细胞的代谢行为。

此外，研究人员还通过多种实验手段验证了系统的长期稳定性。例如，GC@SiO?纳米胶囊在4°C下保存2周后，其内部的酶活性仍然保持在较高水平，这表明二氧化硅壳层对酶的保护作用非常显著。同时，GC@SiO?@Lips-ATPase在模拟生物环境中的表现也显示出良好的适应性，能够在复杂的环境中维持其功能。这些结果表明，该系统不仅在实验室条件下表现出色，还具备应用于更复杂生物环境的潜力。

本研究的成果为合成生物学领域提供了重要的技术基础。通过构建具有自主能量供应能力的人工细胞，研究人员迈出了实现人工生命系统的关键一步。这种人工细胞系统不仅能够模拟自然细胞的代谢功能，还具备良好的可调控性和可扩展性。未来，随着技术的进一步发展，这一系统有望用于构建更加复杂的人工细胞模型，甚至可能发展出具备自主生长、分裂和代谢能力的人工生命体。此外，该系统还可能在生物医学、环境修复和生物传感等领域发挥重要作用，为相关技术的发展提供新的思路和工具。

从更广泛的角度来看，这一研究也反映了合成生物学领域在构建复杂生物系统方面的最新进展。传统的生物系统研究多依赖于天然细胞的结构和功能，而本研究则通过人工构建的方式，模拟了细胞内关键的代谢过程。这种自下而上的方法不仅能够更灵活地控制生物系统的组成和功能，还能够减少对天然细胞的依赖，从而拓展生物技术的应用范围。未来，研究人员可以进一步优化这一系统，使其在不同的环境条件下保持更高的效率和稳定性，同时探索更多可能的代谢路径，以构建更接近自然细胞功能的人工细胞模型。

总之，这项研究通过构建一种高效的模拟线粒体的ATP生成器，成功实现了人工细胞的能量自给自足和代谢耦合。该系统不仅在实验条件下表现出色，还为未来人工细胞的进一步发展提供了重要的理论和技术支持。随着相关技术的不断进步，人工细胞有望在生物医学、生物工程和环境科学等多个领域发挥更大的作用，为人类探索生命本质和开发新型生物技术提供重要的基础。