利用功能性CRISPR-Cas9技术对人类成纤维细胞迁移倾向的遗传决定因素进行敲除筛选

《Biotechnology Progress》：Functional CRISPR-Cas9 knockout screening of the genetic determinants of human fibroblast migration propensity

定向细胞迁移在胚胎发育和肿瘤转移中起关键作用，涉及细胞极化、膜突起形成和黏附解体等复杂机制。本研究通过整合CRISPR-Cas9基因敲除筛选与转 wells迁移实验，系统筛选人成纤维细胞在生化梯度下的迁移相关基因和miRNA。采用三阶段筛选流程排除影响细胞生存和增殖的关键基因，结合单细胞测序和功能通路分析，发现已知迁移相关基因（如BMP7、VAV2）及新靶点（如GPCR家族OR10H1、TAS2R4），揭示G蛋白偶联受体介导的生化信号感知在迁移中的重要作用，为肿瘤转移治疗提供新思路。

　　细胞迁移是生命活动中一个关键的过程，它在许多生理和病理条件下都起着重要作用，如胚胎发育、组织稳态、伤口愈合、免疫反应、慢性炎症以及癌症转移等。这一过程涉及多个复杂的步骤，包括细胞极化、在细胞前端形成膜突起、在后端解聚粘附结构，以及细胞骨架的重排。这些步骤通常受到机械力和生化信号的共同调控，而具体的分子事件则因细胞类型和所处环境的不同而有所差异。因此，要深入理解细胞迁移的调控机制，特别是在特定病理背景下，需要识别出具有细胞特异性功能的分子靶点。

本研究聚焦于人类成纤维细胞在生化梯度下的定向迁移能力，采用了一种将分子功能识别与实际机械作用相结合的方法。我们通过整合高通量基因编辑技术CRISPR-Cas9敲除文库筛选和一种经典的迁移功能检测方法——Transwell迁移实验，系统地筛选出与迁移相关的基因和微小RNA（miRNA）。这一方法的关键在于，在进行筛选前，先对细胞进行扩展培养，以去除那些对细胞存活和增殖至关重要的基因和miRNA，从而确保筛选结果能够更准确地反映与迁移相关的分子机制，而不受其他主要细胞功能的影响。

Transwell迁移实验是一种广泛使用的体外检测方法，用于研究细胞在生化浓度梯度下的趋化行为。实验中，通过在Transwell装置的两个腔室中使用不同浓度的胎牛血清（FBS）来建立生化梯度，观察细胞是否能够主动迁移通过多孔膜。这种方法不仅能够评估细胞的迁移能力，还能提供关于细胞在三维环境中迁移行为的直观信息。为了提高筛选的效率和准确性，我们使用了CRISPR-Cas9技术，构建了一个包含数万个sgRNA的文库，每个基因和miRNA都有多个sgRNA靶向，从而增加了筛选结果的统计显著性。

在实验设计中，首先将人类成纤维细胞（HFF-1）在特定条件下培养，确保其在正常环境中具有良好的生长状态。随后，使用CRISPR-Cas9文库对细胞进行基因编辑，并在体外条件下进行扩展培养，以排除那些对细胞基本功能至关重要的基因和miRNA。接着，将经过编辑的细胞引入Transwell装置，模拟生化梯度下的迁移环境，并进行多轮筛选。在每一轮筛选中，分别收集上层和下层细胞样本，进行基因组DNA提取和深度测序，以分析sgRNA的富集或缺失情况。通过这样的流程，我们能够识别出哪些基因或miRNA在迁移过程中起到了关键作用。

深度测序数据的处理是本研究的重要组成部分。我们使用了定制的脚本对数据进行处理，首先合并配对读取，然后对读取数据进行修剪，以去除低质量的序列。接着，将修剪后的数据映射到人类GeCKO v2文库中，以确定每个sgRNA的表达水平。为了确保数据的可靠性，我们对所有样本进行了严格的过滤，排除了那些在初始筛选或对照组中表达水平过低的sgRNA，以及那些靶向基因或miRNA数量不足的靶点。通过将每个样本与初始样本（Time 0）进行比较，我们对sgRNA的表达进行了中位数归一化处理，并利用Gini指数衡量sgRNA的多样性。Gini指数越高，表示sgRNA的分布越不均，可能意味着某些基因或miRNA在迁移过程中起到了重要作用。

在筛选结果分析中，我们首先将对照组样本与初始样本进行比较，以排除那些在常规培养条件下已表现出显著变化的基因和miRNA。随后，我们比较了迁移实验中上层和下层细胞样本，以识别那些在迁移过程中起关键作用的分子。通过MAGeCK-VISPR算法进行最大似然估计，我们能够计算出每个基因或miRNA的β值，代表其在不同条件下的平均对数倍数变化。我们发现，一些已知的与迁移相关的基因和miRNA在筛选中表现出显著的富集或缺失，这与现有的研究结果一致。同时，我们也发现了一些新的候选分子，这些分子可能在迁移过程中发挥重要作用，但尚未被广泛研究。

通过功能分析，我们发现了一些与细胞迁移密切相关的分子通路和过程，包括Rho GTPase信号通路、WNT信号通路、MAPK信号通路，以及细胞外基质（ECM）的组织和调控。此外，我们还发现了一些与细胞膜运输和离子转运相关的基因，这些基因可能通过调节细胞体积，帮助细胞在狭窄的通道中迁移。值得注意的是，一些与嗅觉和味觉相关的G蛋白偶联受体（GPCR）也显示出与迁移相关的特性。这些受体通常被认为在感知气味和味道中起作用，但我们的研究结果表明，它们在某些病理条件下，如癌症中，可能也参与了细胞迁移的调控。

这一研究不仅确认了已知的与迁移相关的基因和miRNA，还发现了新的候选分子，为未来的研究提供了重要的资源。通过将CRISPR-Cas9基因编辑技术与Transwell迁移实验相结合，我们能够更直接地评估基因和miRNA在细胞迁移中的功能，而不受其他细胞过程的干扰。这种方法的优势在于，它能够提供更精确的分子靶点，同时保留了高通量筛选的统计优势。此外，通过排除与细胞基本功能相关的基因和miRNA，我们能够更专注于那些在特定迁移条件下起作用的分子，为开发针对病理迁移的治疗策略提供了新的思路。

研究结果还表明，G蛋白偶联受体（GPCR）在细胞迁移中可能具有重要的作用。这些受体不仅在感知环境中起作用，还可能通过调控细胞内的信号通路，影响细胞的迁移能力。特别是在某些癌症中，这些受体的表达可能被异常上调，这提示了它们在疾病进展中的潜在作用。因此，针对这些GPCR的干预可能成为治疗病理迁移和癌症转移的新策略。

总的来说，本研究通过整合CRISPR-Cas9基因编辑技术和Transwell迁移实验，建立了一种新的方法，用于识别与细胞迁移相关的基因和miRNA。这种方法不仅提高了筛选的准确性，还为理解细胞迁移的分子机制提供了新的视角。研究结果为未来的研究和治疗策略提供了重要的线索，特别是在探索与细胞迁移相关的分子靶点方面。此外，研究还揭示了某些新型分子可能在迁移过程中发挥关键作用，这为进一步的实验研究和临床应用奠定了基础。