关于用于离子对反相液相色谱分离寡核苷酸的高级离子配对共梯度技术的思考

《Journal of Chromatography A》：Considerations on advanced ion pairing co-gradients for ion-pair reversed phase liquid chromatography separations of oligonucleotides

双梯度协同优化离子对反相色谱分离寡核苷酸新方法

　　离子对反相液相色谱（IP-RPLC）是一种广泛应用于分离带有电荷或可电离化合物的分析技术，尤其是在寡核苷酸（ONs）的分离中。这项研究引入了一种新的方法，通过独立或组合应用有机共溶剂和离子对（IP）试剂的梯度，为离子对反相液相色谱的分离策略带来了更灵活的选择。在传统方法中，通常采用单一的IP试剂和固定或逐渐变化的有机共溶剂梯度，而这种新方法则允许同时优化两种变量，从而显著提高分辨率和选择性。通过四通道泵系统，研究者能够实现线性或分段梯度的灵活控制，这为方法开发提供了更多的自由度。

在IP-RPLC中，离子对试剂的作用是改变分析物与固定相之间的相互作用，使其能够被保留。这些试剂通常根据其有效强度分为弱、中等和强三种类型，它们的吸附能力和疏水性决定了它们在不同条件下的行为。弱离子对试剂如三乙胺（TEA）倾向于促进疏水保留机制，而强离子对试剂如四丁基铵或己胺（HA）则更有利于离子交换机制，从而增强对强电荷化合物的保留和分离能力。研究者发现，通过改变两种试剂的浓度，可以实现对分离选择性的更精细调控。

本研究提出了一个半经验模型，用于描述保留行为如何随共溶剂和IP试剂浓度的变化而变化。这个模型使得在复杂的梯度程序中能够预测保留时间，并且能够用于优化分离条件。实验结果显示，这种多变量梯度策略在分辨率和选择性方面显著优于传统方法。此外，这种方法不仅实用，而且易于实施，适用于现代分析流程，特别是在治疗性寡核苷酸的开发中。

研究还探讨了不同梯度组合对保留时间的影响。例如，当使用正向IP试剂浓度梯度时，保留时间窗口会变宽，这有助于分离具有广泛大小或长度分布的寡核苷酸混合物。相反，负向IP试剂浓度梯度会导致保留时间窗口的压缩，这对于需要精确选择性调整的分析任务可能是有益的。通过将共溶剂梯度与弱到强IP试剂梯度结合，研究者展示了如何进一步扩展保留时间窗口，提高分辨率，并发现以前未实现的选择性配置。

在实验部分，研究者使用了多种IP试剂，包括弱离子对试剂如DIPEA和强离子对试剂如HA，通过不同的梯度设置来测试其对分离效果的影响。实验中，共溶剂梯度和IP试剂浓度梯度的组合被证明可以显著改善寡核苷酸的分离效果。此外，通过分段梯度策略，研究者还能够针对色谱图中特定区域进行优化，从而进一步提高方法的灵活性和选择性。

研究还考虑了可能的pH效应。虽然双梯度方法可能会引起色谱流出液pH的变化，但寡核苷酸的磷酸骨架在pH 7以下已完全去质子化，其碱基的pKa值也超出了实验考察的范围，因此其电离状态对pH变化不敏感。然而，残余硅醇基团的逐步去质子化可能会影响吸附的离子对层的组织，从而对保留行为产生微妙影响。此外，寡核苷酸的序列依赖性构象变化也可能发生，但通常需要更极端的pH条件才能观察到显著的结构变化。

从实用角度来看，这种方法的实施并不需要特殊仪器，只需四通道梯度色谱系统即可实现共溶剂和IP试剂浓度的独立控制。通过仅需四到六次梯度实验即可校准半经验模型，使得在各种梯度条件下能够准确预测保留行为。这种方法不仅加速了方法开发的进程，还为优化寡核苷酸分离提供了强有力的支持。

总之，这项研究为寡核苷酸的离子对反相液相色谱分离提供了新的思路，通过同时调整共溶剂和IP试剂的浓度梯度，可以实现更精细的选择性调控。研究结果表明，这种策略在分辨率、选择性和保留时间预测方面具有显著优势，为寡核苷酸的分析和质量控制带来了新的可能性。