含有锌离子载体（Zn-Ionophore）和聚集抑制基团的双功能分子的评估，用于突变型p53蛋白的重新激活

《Journal of Inorganic Biochemistry》：Evaluation of dual-function molecules containing both Zn-Ionophore and aggregation inhibition moieties for mutant p53 protein reactivation

两个新型多齿N,O供体配体L-I-A和L-H-A通过结合IDA金属结合基团与苯并噻唑唑酮单元，有效恢复突变p53的Zn2?结合能力并抑制蛋白聚集，同时保持低细胞毒性和ROS不升高，揭示了DPA单元和酚氧基对活性及机制的关键影响。

　　p53蛋白是细胞中一种重要的转录因子，其功能在防止癌症、调节细胞衰老、细胞周期停滞、DNA修复以及最终促使受损细胞凋亡中发挥关键作用。p53蛋白常被称为“基因组的守护者”，在维持细胞和器官完整性方面具有不可或缺的意义。然而，许多癌症的发生与p53蛋白的功能受损密切相关，其中超过50%的癌症患者存在p53的点突变。这些突变通常会影响p53的DNA结合能力，导致其结构不稳定，最终引发细胞异常增殖和癌变。因此，恢复突变p53蛋白的结构和功能成为癌症治疗研究的一个重要方向。

为了应对这一挑战，科学家们开发了一系列基于金属离子调控的策略，旨在通过特定的金属配体来修复突变p53蛋白的结构。这些配体通常设计为能够与锌离子（Zn2?）结合，从而恢复p53蛋白的折叠和活性。同时，它们也被设计为能够抑制突变p53蛋白的异常聚集，以减少其在细胞内的毒性作用。在这一背景下，研究团队开发了两种新型的多齿N,O供体配体，命名为L_I-A和L_H-A，用于评估其在恢复突变p53蛋白Zn2?结合能力以及抑制蛋白聚集方面的潜力。

这些新配体的设计基于对已知结构的优化，结合了两种关键的化学基团：一种是具有良好Zn2?结合亲和力和Cu2?/Zn2?选择性比的iminodiacetate（IDA）金属结合单元；另一种是已被证明能够限制突变p53蛋白聚集的benzothiazole（苯并噻唑）单元。通过这样的设计，研究团队希望能够在不引起细胞毒性的情况下，有效恢复p53蛋白的结构和功能。实验结果表明，这两种新型配体在低纳摩尔（nM）范围内表现出良好的Zn2?结合能力，这通过荧光竞争实验得以验证。此外，它们在抑制突变p53蛋白聚集方面也显示出积极效果，这一结果通过Thioflavin-T（ThT）实验得以确认。

在细胞实验和NCI-60细胞系筛选中，这两种新配体并未表现出显著的细胞毒性，这表明它们在选择性作用方面具有优势。然而，一个与先前研究相关的L_I化合物则显示出能够增加细胞内的活性氧（ROS）水平。这一发现进一步揭示了该类化合物的作用机制，即某些配体可能通过促进红ox活性金属离子（如Cu?/Cu2?和/或Fe2?/Fe3?）的运输和Fenton-like化学反应，导致ROS的生成，从而可能引发非特异性的毒性反应。因此，研究团队在设计这些新配体时，特别关注了如何通过调整其结构，优化Zn2?与Cu2?的结合比例，以尽可能减少ROS的生成和非靶向毒性。

在进一步的实验中，研究团队发现，将吡啶供体替换为羧酸基团，可以显著降低Cu2?的结合亲和力，从而减少ROS的生成。这种结构上的调整使得L4-A配体相较于其前体L4-P表现出更低的Cu2?结合能力。然而，由于L4-A配体的低脂溶性，其在生理pH条件下的Zn2?配合物可能无法有效发挥离子载体活性，从而导致其在细胞中的毒性较低。基于这一发现，研究团队进一步尝试在L4-A的基础上引入苯并噻唑单元，以期提高配体的脂溶性，从而增强其在细胞内的活性。

最终，L_I-A和L_H-A这两种新型配体在脂溶性和Zn2?结合能力方面得到了显著改善，同时仍然保持了对突变p53蛋白聚集的抑制效果。实验结果表明，这两种配体不仅能够有效恢复突变p53蛋白的结构和功能，还能够减少其在细胞内的非特异性毒性。此外，它们的结构优化也为未来设计更高效的金属离子载体提供了新的思路和方向。

在合成和表征方面，研究团队采用了一种高效的合成方法，即通过Duff反应合成了所需的苯并噻唑醛（4a和4b），随后通过还原胺化反应将其与二乙基iminodiacetate（5）结合，从而形成了L_I-A-DEE和L_H-A-DEE。这些化合物的合成过程不仅需要精确的化学步骤，还需要对反应条件进行优化，以确保产物的纯度和结构的正确性。通过进一步的实验，研究团队验证了这些配体在细胞内的渗透性和稳定性，以及它们在抑制突变p53蛋白聚集方面的有效性。

为了评估这些新配体的抗癌潜力，研究团队进行了多种实验，包括细胞毒性测试、ROS生成分析、蛋白聚集抑制实验等。这些实验不仅提供了关于配体生物活性的详细数据，还揭示了它们在细胞内的作用机制。例如，细胞毒性测试结果显示，这些新配体在多种细胞系中均未表现出显著的毒性，这表明它们在选择性作用方面具有良好的前景。而ROS生成分析则进一步表明，这些配体能够有效减少细胞内的活性氧水平，从而降低其在细胞内的非特异性毒性。

此外，研究团队还发现，这些新配体在抑制突变p53蛋白聚集方面表现出良好的效果。通过Thioflavin-T（ThT）实验，他们验证了这些配体能够有效减少蛋白聚集，这表明它们在癌症治疗中的潜在应用价值。这一发现不仅为开发新型抗癌药物提供了新的思路，也为理解突变p53蛋白的聚集机制和抑制策略提供了重要的科学依据。

在研究过程中，团队成员分工明确，各司其职。Kalvin Kwan负责化合物的合成和实验设计，同时参与了数据的分析和论文的撰写。Ashkan Saffari和Lauryn Grcic则负责蛋白聚集研究和金属结合能力的评估。Alfredo L. Acosta、Grace Leech、Benjamin Ma和Omar Castro-Sandoval参与了细胞实验和数据收集。Christophe Orvain和Tim Storr则负责项目的整体监督和指导。这种团队合作模式不仅提高了研究的效率，也确保了实验结果的准确性和可靠性。

研究的资助来自多个机构，包括加拿大自然科学和工程研究委员会（NSERC）的发现基金（RGPIN-2019-06749），以及B.C.研究生奖学金和Mitacs全球奖学金。此外，法国的研究工作得到了Ligue Contre le Cancer、Itmo Cancer、CNRS和Inserm的资助支持。这些资金的投入为研究的顺利进行提供了重要的保障，同时也体现了科研工作的国际协作性质。

在材料和方法方面，研究团队采用了高纯度的化学试剂，并通过多种实验手段对化合物的结构和性质进行了详细分析。例如，使用Bruker-AV-500和600仪器记录了1H和13C核磁共振（NMR）数据，以确认化合物的化学结构。同时，使用Agilent 6210飞行时间电喷雾离子化质谱（TOF ESI）对化合物的分子量和化学组成进行了分析。这些实验方法不仅确保了数据的准确性，也为后续的实验提供了可靠的参考。

总的来说，这项研究为开发新型的抗癌药物提供了重要的科学依据。通过设计和合成两种新型的多齿N,O供体配体，研究团队成功地恢复了突变p53蛋白的Zn2?结合能力，并有效抑制了其异常聚集。这些结果不仅表明了配体在癌症治疗中的潜力，也揭示了其在优化金属离子选择性和减少非特异性毒性方面的关键作用。未来的研究可以进一步探索这些配体在体内环境中的表现，以及它们在更广泛癌症类型中的应用价值。同时，这些研究成果也为其他相关领域的研究提供了新的思路和方向，例如在设计具有更高效抗癌活性的金属离子载体方面。