利用cfDNA克隆进化追踪揭示卵巢癌耐药机制与进化适应性治疗新策略

《Nature》：Tracking clonal evolution during treatment in ovarian cancer using cell-free DNA

本研究针对高级别浆液性卵巢癌(HGSOC)化疗耐药难题，开发了CloneSeq-SV技术，通过单细胞全基因组测序(scWGS)联合循环肿瘤DNA(ctDNA)中克隆特异性结构变异(SVs)追踪，揭示耐药克隆在诊断时即存在且具有CCNE1、ERBB2等基因扩增特征，证明进化动力学主导临床耐药，为个体化适应性治疗提供新范式。

　　

高级别浆液性卵巢癌(HGSOC)是女性生殖系统最常见的致命恶性肿瘤，尽管患者初期对铂类化疗有反应，但绝大多数会出现复发并最终死于疾病进展。耐药性的出现是治疗失败的主要原因，而由于肿瘤异质性和动态进化，传统的静态活检难以捕捉耐药克隆的演化轨迹。更关键的是，卵巢癌的纵向组织取样在临床上既不可行也不推荐，这限制了对耐药机制实时监测的能力。

为解决这一难题，Memorial Sloan Kettering癌症中心的Marc J. Williams、Ignacio Vázquez-Garcia等研究人员在《Nature》发表了创新性研究，他们开发了名为CloneSeq-SV的新方法，将单细胞全基因组测序(scWGS)与时间序列细胞游离DNA(cfDNA)中克隆特异性基因组结构变异的靶向深度测序相结合，实现了在患者治疗过程中对共存的克隆群体进行相对丰度测量和进化分析。

关键技术方法

研究团队对24例初治III-IV期HGSOC患者进行多模态前瞻性研究，收集基线肿瘤组织进行scWGS分析(共21,916个肿瘤细胞)，利用MEDICC2构建单细胞系统发育树鉴定克隆结构。同时设计患者特异性杂交捕获探针，对纵向血浆cfDNA样本(平均每位患者7.9个时间点)进行双链纠错深度测序，追踪克隆特异性SVs作为内源性标志物。通过Wright-Fisher模型进行进化动力学建模，并结合匹配的单细胞RNA测序(scRNA-seq)数据分析克隆特异性转录程序。

克隆特异性突变和结构变异鉴定

研究人员首先通过scWGS数据推断诊断时的克隆组成，利用新开发的HMMclone隐马尔可夫模型拷贝数呼叫器在10kb分辨率下计算克隆特异性拷贝数谱。他们发现结构变异作为高度特异的内源性基因组标志物，能够有效区分主干突变和克隆特异性事件。例如在患者004中，主干TP53突变均匀分布所有克隆，而两个克隆特异性单核苷酸变异(SNVs)和重复则显示克隆限制性分布。

体细胞肿瘤SVs在cfDNA中的检测性能

与传统的SNVs相比，SVs在cfDNA检测中表现出更优的信噪比特性。研究显示SVs的错误率比SNVs低几个数量级，即使在未校正的测序中也可忽略不计(1×10^-7vs 4×10^-4)。此外，SVs常与高水平扩增相关，导致高每细胞拷贝数，进一步增强了检测灵敏度。所有21个术前血浆样本均通过SVs和SNvs检测到肿瘤DNA，且变异等位基因频率(VAF)分布一致。

克隆特异性SVs在cfDNA中的检测

在24例患者中，22例检测到scWGS分析推断的高置信度克隆特异性SVs(平均54个，范围9-233)。这些变异由多种突变过程产生，包括染色体碎裂(chromothripsis)、断裂-融合-桥循环(breakage-fusion bridge cycles)、pyrgo样串联重复"塔"和复杂染色体内事件。即使在肿瘤分数低于1%的低肿瘤分数血浆中，也能检测到克隆特异性SVs。

患者耐药进化动力学

对18例影像学确认疾病复发患者的分析显示，所有患者初始化疗期间truncal SVs的ctDNA VAF均下降，但在首次复发时点均检测到ctDNA。在11例有足够血浆样本的患者中，在临床确认疾病复发前但初始化疗完成后检测到ctDNA(平均提前243天)。克隆丰度追踪显示，耐药通常源于诊断时存在的单个或小部分克隆的选择性扩增。

典型案例中，患者044诊断时存在两个主要克隆(克隆B和E)，克隆B具有ERBB2高水平扩增(平均30.1个拷贝)。患者对前期化疗有反应，但在第449天经历疾病复发，复发后cfDNA样本仅检测到ERBB2扩增的克隆B。随后患者接受trastuzumab deruxtecan(T-DXd)治疗，获得持久完全缓解。

患者009中，所有五个克隆在诊断时均被检测到。化疗后患者实现ctDNA清除，但在PARP抑制剂维持治疗近3年后复发，复发后仅检测到克隆F。研究人员在复发后cfDNA样本中鉴定出BRCA1回复突变，这可能与PARP抑制剂耐药相关。

两例患者携带克隆特异性CCNE1扩增，这一改变与HGSOC的疾病复发和化疗耐药相关。患者107中克隆D在复发时占主导，除CCNE1拷贝数增加外，还有包含NOTCH3的19p高水平扩增。患者045中，虽然CCNE1扩增克隆在诊断时占主导，但复发后缺乏CCNE1扩增但携带RAB25扩增的克隆D扩增并占主导，表明基线CCNE1扩增与化疗耐药并非确定性相关。

克隆特异性转录程序

通过TreeAlign将scRNA-seq细胞映射到基因组定义的克隆，研究人员发现同一患者不同克隆间的转录程序存在高度变异，表明HGSOC具有大量预先存在的、基因组相关的转录异质性。在患者107中，复发主导克隆D显示较高NOTCH3表达、VEGF通路评分和HIF1A表达。患者009中复发克隆F显示JAK-STAT通路基因表达较低、上皮-间质转化(EMT)程序增加和较低比例的循环细胞，这些表型状态可能与化疗耐药相关。

进化动力学建模

通过Wright-Fisher模型量化克隆轨迹的进化特性，发现16例患者中11例至少有一个克隆的频率变化与中性漂移不一致，表明治疗期间大多数患者存在选择压力。整体多样性以香农熵衡量，在最终时点相对于基线下降(P=0.018)，检测到的克隆数量也减少(P=0.0066)，表明治疗压力下克隆复杂性降低。

研究结论与意义

本研究证明利用SVs作为内源性标志物追踪癌症患者耐药克隆进化是可行的。研究发现尽管耐药机制具有异质性和患者特异性，但跨患者的重复特征包括克隆特异性高水平扩增潜在可靶向癌基因。重要的是，耐药状态在诊断时即预先存在，导致阳性选择和复发时克隆复杂性降低。这些发现为进化指导的适应性治疗方案研究提供了动力，有望在未来HGSOC研究中消除耐药性。

该研究框架可推广到其他以多克隆疾病和基因组不稳定性为特征的癌症，如三阴性乳腺癌、高级别子宫内膜癌和EGFR突变肺癌。虽然耐药可能涉及多种机制，但该方法能够量化患者治疗选择压力的贡献，为进化指导的适应性临床试验奠定基础。