微型CRISPR-Cas10酶通过抑制性信号传导赋予抗病毒免疫的新机制

本研究揭示了细菌中一种新型抗噬菌体防御系统Panoptes（mCpol-2TMβ），它通过组成性合成c-di-AMP抑制毒性效应蛋白2TMβ的寡聚化。当噬菌体编码的抗CBASS蛋白（Acb）降解c-di-AMP时，会触发2TMβ介导的细胞死亡，从而阻止病毒传播。这种"分子哨兵"机制为理解免疫信号传导提供了新范式。

　　

在微生物与病毒共同进化的漫长历程中，生物体发展出了多种基于寡核苷酸信号的免疫机制。这些机制在细菌的CBASS（cyclic oligonucleotide-based antiphage signalling systems）和III型CRISPR系统，以及人类的cGAS-STING（cyclic GMP-AMP synthase-stimulator of interferon genes）通路中都有体现。在这些经典通路中，细胞在检测到病毒或外源遗传物质后会合成寡核苷酸信号分子，从而激活抗病毒反应。

然而，在这项发表于《Nature》的研究中，科学家们发现了一个令人惊讶的"逻辑反转"现象。由Erin E. Doherty和Benjamin A. Adler等研究人员领导的团队发现，一种名为mCpol（minimal CRISPR polymerase）的CRISPR相关酶能够持续合成环状寡核苷酸，作为主动抑制毒性效应蛋白的机制。这种新颖的防御策略被称为Panoptes系统，它代表了一种强大的对抗病毒介导的免疫抑制的防御策略，扩展了我们对寡核苷酸在免疫中作用的理解。

为了开展这项研究，研究人员采用了多种关键技术方法：使用大肠杆菌模型系统进行噬菌体挑战实验和生长曲线分析；通过X射线晶体学解析mCpol与ApNHpp的复合物结构（分辨率2.28?）；利用高效液相色谱-质谱联用技术（HPLC-MS）鉴定酶反应产物；采用热迁移实验和尺寸排阻色谱分析蛋白质-配体相互作用；通过荧光显微镜观察细胞膜完整性；使用CRISPRi-ART技术进行基因功能筛选；并开展生物信息学分析研究mCpol基因的基因组分布和进化关系。

mCpol contributes to antiphage defence

研究人员在大肠杆菌ECOR31的Hachiman抗噬菌体防御系统附近发现了一个相邻的操纵子，该操纵子编码mCpol和一个2TMβ蛋白（命名为Panoptes）。实验证明，表达该Panoptes操纵子能够提供10³-10⁴倍的保护作用，抵抗T4、MM02和N4噬菌体的感染。在低感染复数（MOI≤0.01）条件下，Panoptes通过限制早期感染轮次中的病毒产生来提供群体水平的抗噬菌体保护。

Crystal structure of mCpol and biochemical detection of adenylate cyclase activity

通过薄层色谱（TLC）和高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）分析，研究人员发现mCpol能够利用ATP合成2'3'-环二腺苷酸（2'3'-c-di-AMP）。X射线晶体结构显示mCpol含有Cas10样的PALM结构域，能够形成二聚体口袋结合两个ATP类似物。与Cas10不同的是，mCpol中的ATP底物在活性位点呈对称排列，这解释了为什么mCpol只产生c-di-AMP而不产生更高级的环寡腺苷酸（cOAs）。

mCpol signalling inhibits 2TMβ effector

研究发现mCpol是一个组成性活跃的环化酶，不需要像Cas10那样需要RNA结合来激活。这种组成性活性引发了一个重要问题：持续的c-di-AMP合成如何实现对噬菌体感染的特异性免疫应答？研究人员发现增加mCpol-2TMβ的表达反而会降低噬菌体防御效果，这表明Panoptes系统可能通过mCpol介导的负向调控发挥作用，类似于毒素-抗毒素（TA）系统。

c-di-AMP blocks 2TMβ-induced cell lysis

实验证实mCpol和2TMβ之间存在毒素-抗毒素关系。2TMβ表达对细胞存活和生长具有有害影响，而mCpol表达能够抑制这种毒性效应。mCpol催化突变体（D57A）则无法抑制2TMβ毒性。AlphaFold 3预测2TMβ包含N端跨膜螺旋和C端β-桶结构域，与CBASS效应蛋白Cap15结构相似。热熔实验显示2'3'-c-di-AMP能够显著稳定2TMβ(△2TM)，表明配体直接与蛋白质结合。

Acb proteins activate 2TMβ toxicity

研究发现噬菌体编码的Acb（anti-CBASS）蛋白对于激活Panoptes防御是必要且充分的。使用CRISPRi-ART技术敲低Acb蛋白（Acb4_N4和Acb2_T4）能够恢复噬菌体的感染能力。低水平的Acb1_T4、Acb2_T4和Acb4_N4表达都足以激活Panoptes诱导的细胞死亡，而酶活失活的Acb1_T4和结合位点突变的Acb2_T4则无此效果。

研究结论表明，Panoptes位点编码了一个由Cas10样寡核苷酸环化酶（mCpol）和CBASS样效应蛋白（2TMβ）组成的防御系统，能够对抗噬菌体编码的抗防御机制。mCpol是一个组成性活性酶，能够产生c-di-AMP来稳态抑制其2TMβ效应蛋白的寡聚化。c-di-AMP的缺失会触发2TMβ寡聚化和由于内膜崩溃导致的细胞死亡，这一过程由噬菌体抗防御蛋白（如消耗环寡核苷酸信使的抗CBASS蛋白）激活。

这种抑制性信号逻辑与目前已知的CBASS系统相比代表了一种信号传导逻辑的反转，因为每个系统中的2TMβ效应蛋白对小分子刺激的反应相反。环核苷酸既能够激活也能够抑制同源受体的能力，反映了在环二GMP信号传导中观察到的机制灵活性。据研究人员所知，这是第一个表现出毒素-抗毒素调控机制的免疫信号系统，其中信号分子负责效应蛋白的抑制。

Panoptes对抗广泛破坏环寡核苷酸的噬菌体抗防御蛋白，作为抗病毒防御中免疫信号通路的安全保障。对紧密相关的多种CBASS系统的生物信息学分析显示，Panoptes和CBASS免疫信号通路之间存在显著的协同作用。这种协同作用意味着抗免疫蛋白面临着进化压力，需要发展更精确的免疫信号分子识别能力，这可能会以广谱免疫逃逸为代价。跨界的免疫逃逸机制施加了共享的进化压力，表明在真核免疫中可能会发现类似的信号架构。

这项研究结果揭示了抑制信号免疫系统的病毒蛋白进化的一个主要约束，并表明了环寡核苷酸在整个生命树中可能具有类似的保护作用。这种新型防御机制的发现不仅扩展了我们对细菌抗病毒防御的理解，也为开发新型抗病毒策略提供了重要启示。