整合的非靶向代谢组学和转录组学研究揭示了Pantoea camelliae Z09菌在液态发酵过程中高效合成theabrownins的过程

《LWT》：Integrated untargeted metabolomics and transcriptomics revealed the high-efficiency synthesis of theabrownins by Pantoea camelliae Z09 in liquid-state fermentation

茶褐素（TBs）高效合成机制及多组学解析。采用Pantoea camelliae Z09液态发酵，结合代谢组学与转录组学，发现7种主要茶多酚（C、EC、GC等）及槲皮素、橙皮苷等关键成分参与TBs形成，鉴定322种差异代谢物及145个关键基因（包括PPO、POD、GHs等），揭示pH动态调控（6.98→7.43）与氧化聚合协同作用，建立四阶段合成模型（0-8h酯解、8-24h氧化聚合、24-36h结构修饰、36-48h稳定）。12.57 mg/mL TBs浓度创菌种间新高，为规模化生产提供理论依据。

　　茶褐素（Theabrownins, TBs）作为一种复杂的水溶性棕色聚合物，因其显著的健康效益和广阔的市场前景，成为研究的热点。TBs的分子量范围广泛，从3.5 kDa到超过100 kDa，主要存在于黑茶中，占其成分的7.06%至16.41%。TBs的形成主要依赖于茶多酚的酶促氧化和聚合过程，通常与碳水化合物、蛋白质和咖啡因结合。其结构包含羟基、羧基、烷基和芳香基团，不仅影响茶叶的色泽和风味，还展现出抗肿瘤、抗氧化及抗骨质疏松等多种生物活性，因此在食品工业、医药领域和功能性食品开发中具有重要应用价值。

然而，传统的TBs提取方法主要依赖于固态发酵，虽然有效，但其较长的发酵周期（30-60天）和较低的TBs含量限制了提取效率和产量，进而提高了生产成本，阻碍了其商业化进程。近年来，液态发酵技术因其较短的生产周期、较高的效率、均匀的发酵效果和良好的可扩展性，被认为是TBs生产的一种有前景的方法。多种真菌，如黑曲霉（*Aspergillus niger*）、管囊霉（*Aspergillus tubingensis*）和球抱霉（*Eurotium cristatum*）已被用于液态发酵以提升TBs的含量。此外，一些研究指出细菌在茶成分转化中也发挥重要作用，如*Pantoea*、*Klebsiella*和*Pseudomonas*等菌种。由于细菌具有生长周期短、易于控制等优势，被认为是TBs合成的潜在微生物来源，但其在液态茶发酵中的具体功能仍需深入探索。

在本研究中，我们选择了一株从云南晒青绿茶（*Camellia sinensis* var. *assamica*）中分离出的*Pantoea camelliae* Z09菌株（CCTCC AB 2021544^T^）进行液态发酵实验。该菌株形成黄色、湿润、凸起的菌落，为革兰氏阴性菌，其细胞形态为短杆状，主要通过二分裂进行繁殖，且缺乏鞭毛。初步筛选表明，该菌株在液态发酵条件下能有效促进TBs的合成。然而，其高效合成机制仍不清楚，因此有必要通过多组学方法来深入解析这一过程，以加深对TBs组成和提升其工业应用潜力的理解。

随着多组学技术的发展，研究人员能够更全面地理解复杂的生物过程。代谢组学通过系统分析小分子代谢物，揭示其种类、丰度及动态变化，而转录组学则提供基因表达的定量信息，帮助识别不同条件下的调控机制。TBs的合成不仅受酶活性的影响，还受到茶汤中代谢物相互作用的调节。因此，结合代谢组学和转录组学的方法能够更全面地分析TBs的合成过程。

本研究的目标是通过*P. camelliae* Z09菌株在液态发酵过程中的作用，阐明TBs高效合成的机制。通过光谱技术及Curie点热裂解气相色谱-质谱联用技术（CP-Py-GC-MS），系统地表征了不同时间点TBs的结构和组成。此外，通过定量分析、非靶向代谢组学和转录组学方法，进一步分析了主要化学成分、代谢物及基因表达的动态变化。多变量统计分析帮助识别了与TBs合成相关的关键化合物和基因，随后通过转化实验和实时定量PCR（RT-qPCR）进行了验证。通过整合多组学数据与功能验证，本研究不仅建立了理解微生物驱动TBs合成的框架，还提供了提高合成效率和推动TBs大规模工业生产的全新策略。

在材料与方法部分，我们采用了多种先进的技术和方法。首先，我们从云南晒青绿茶中获取了原材料，并从多个供应商处购买了高纯度的化学试剂，包括儿茶素、没食子酸、咖啡因、茶黄素、茶红素等。随后，我们制备了*P. camelliae* Z09的初始菌种，并在20 L的发酵系统中进行了48小时的液态发酵实验，每隔4小时采集一次样本，用于后续分析。样本经离心处理后，分别收集上清液和沉淀物，以进行不同阶段的分析。

为了表征TBs在不同时间点的结构和组成，我们采用了一系列分析技术。其中包括紫外-可见光谱（UV-vis）和傅里叶变换红外光谱（FT-IR）分析，以及CP-Py-GC-MS分析。UV-vis光谱显示，TBs在290 nm处有强吸收峰，并在370 nm处出现弱肩峰，表明其结构中含有芳香族或共轭双键结构，以及羟基、羧基和氨基等官能团。FT-IR光谱进一步验证了TBs的结构特征，显示出O-H伸缩振动的强宽吸收峰，以及C-H、C=O和芳香环C=C骨架的特征峰，支持TBs主要由多羟基化合物组成。

在TBs合成过程中，茶汤的颜色变化与TBs的积累密切相关。茶汤的颜色从明亮的橙黄色逐渐转变为油性深棕色，这一变化与TBs的合成过程相吻合。通过颜色参数测量，我们发现L*值（亮度）在前32小时内迅速下降，随后趋于稳定，而a*值（红绿度）和b*值（黄蓝度）则在前8小时内增加，之后下降并稳定。这表明TBs的合成是一个动态的过程，涉及多种代谢物和酶的协同作用。

在TBs合成过程中，茶汤的pH值变化也值得关注。pH值在前8小时内迅速上升，随后下降并趋于稳定，这一变化与TBs的合成过程一致。pH值的升高可能与关键酶的活性变化有关，如多酚氧化酶（PPO）和过氧化物酶（POD），这些酶对pH高度敏感，其活性在酸性和碱性条件下均会下降。此外，随着TBs含量的增加和多酚底物的消耗，底物-产物平衡的变化可能进一步影响这些酶的表观活性。因此，pH值可能通过直接调节关键酶的活性和间接影响酶活性的底物-产物动态变化，从而调控TBs的合成。

在非靶向代谢组学分析中，我们对不同时间点的发酵茶汤进行了分析，以识别与TBs合成相关的代谢物。通过主成分分析（PCA）和偏最小二乘判别分析（PLS-DA），我们发现五个样本在代谢物组成上存在显著差异，且样本在不同时间点聚集，表明代谢物在发酵过程中发生了明显的转化。通过变量重要性投影（VIP）和t检验分析，我们识别出322种显著差异的代谢物，这些代谢物在TBs合成过程中可能起到关键作用。

在转录组学分析中，我们对*P. camelliae* Z09在不同发酵时间点的基因表达进行了研究。在8、24和36小时三个时间点，我们分别提取了总RNA，并通过高通量测序分析了基因表达情况。结果显示，PT36组（36小时）与PT8组（8小时）相比，有1,874个差异表达基因（DEGs），其中1,089个基因上调，785个基因下调。此外，PT36组与PT24组相比，有更多DEGs上调，表明在24-36小时之间，酶活性显著增强，从而加速了TBs的合成。通过GO和KEGG注释分析，我们发现这些上调的DEGs主要参与环境适应、跨膜运输、氧化还原反应等生物学过程。

为了进一步识别与TBs高效合成相关的基因，我们采用了双向正交偏最小二乘分析（O2PLS）。TBs作为Y矩阵，而上调的DEGs作为X矩阵，通过O2PLS模型，我们筛选出729个VIP值大于1.0的基因，表明这些基因在TBs的高效合成过程中发挥关键作用。这些基因主要涉及化合物的降解、结构修饰和氧化还原反应。例如，降解相关的基因包括多种水解酶，如糖苷酶、蛋白酶、酯酶、单宁酶、氨基水解酶和肽酶。结构修饰相关的基因包括糖基转移酶、氨基转移酶和甲基转移酶，这些酶通过修饰化合物的官能团，促进TBs的形成。氧化还原反应相关的基因包括多酚氧化酶（PPO）、过氧化物酶（POD）和醛脱氢酶（ALDH），这些酶在TBs的合成过程中起到关键作用。

此外，我们还对一些特定的基因进行了靶向筛选，以确认其在TBs合成中的作用。例如，我们发现与化合物降解相关的24个基因，包括多种蛋白酶、氨基水解酶和糖苷酶；与结构修饰相关的33个转移酶基因，包括甲基转移酶、糖基转移酶和氨基转移酶；以及与氧化还原反应相关的18个基因，包括PPO和POD等。这些基因的表达模式与RNA-seq结果一致，通过qRT-PCR验证了其可靠性。其中，某些基因如tannase（pA_gene 0422）、酯酶（gene 0987、gene 0419）、PPO（gene 0846、gene 0486）、POD（gene 1802、gene 2266、gene 2994）、O-甲基转移酶（gene 1387）、糖苷酶（gene 0543、gene 3435、gene 2925）和糖基转移酶（gene 1269、gene 3722、gene 2917）被确认为TBs合成的核心基因。

通过代谢物和基因的联合分析，我们进一步揭示了TBs高效合成的全过程。根据实验结果，TBs的合成可以分为四个阶段：0-8小时，酯酶和单宁酶将酯型儿茶素水解为非酯型儿茶素，其中七种儿茶素（C、EC、GC、EGC、ECG、GCG和EGCG）被确认为TBs合成的主要贡献者；8-24小时，TBs主要通过茶黄素（TFs）的氧化聚合形成茶红素（TRs）和TBs，同时，茶黄素和茶红素的含量在此阶段显著增加；24-36小时，除了茶黄素和茶红素外，其他酚类化合物和多酚类物质也发生转化，导致其含量下降，而没食子酸、黄酮醇、芹菜素和槲皮素等化合物的加入显著提升了TBs的合成；36-48小时，TBs含量略有上升，但代谢物差异逐渐缩小，表明化合物转化已趋于稳定。在此阶段，补充新鲜茶汤有助于维持TBs的合成，支持大规模连续生产。

综上所述，本研究通过整合代谢组学和转录组学分析，揭示了*P. camelliae* Z09菌株在液态发酵过程中高效合成TBs的机制。我们不仅识别了七种儿茶素、没食子酸、黄酮醇、芹菜素、槲皮素等关键化合物，还筛选出包括单宁酶、酯酶、PPO、POD、O-甲基转移酶、糖苷酶和糖基转移酶在内的145个候选基因。这些化合物和基因的协同作用构成了TBs生物合成的核心网络。本研究为TBs的高效大规模生产提供了理论依据，并为阐明微生物驱动的宏分子合成机制建立了新的范式，有助于推动TBs在生物技术和功能性食品领域的应用。