一种基于肝素钠的单管RPA/SCas12a扩增策略，以及一种可通过智能手机读取的、经过硫代磷酸修饰的G-四链体驱动的比色检测器，用于在现场废水样本中检测猴痘病毒DNA

《Microchemical Journal》：A heparin sodium-based one-tube RPA/SCas12a amplification strategy and smartphone-read phosphorothioate-modified G-quadruplex-powered colorimetric detector for on-site detection of monkeypox virus DNA in wastewater

检测城市污水中的猴痘病毒DNA，开发基于重组酶聚合酶扩增（RPA）和分裂型CRISPR/Cas12a（SCas12a）的便携式色imetric biosensing平台，通过硫酸磷修饰的G四联体探针（psHG4）与血红素的协同作用，结合智能手机的RGB值分析，实现低至3 aM的检测限，有效抑制环境干扰并提升检测效率。

　　这项研究聚焦于开发一种便携式、灵敏且适用于现场检测的生物传感器，用于在城市污水中快速识别猴痘病毒（MPXV）的DNA。该技术结合了多种先进的分子诊断手段，包括重组酶聚合酶扩增（RPA）、CRISPR/Cas12a信号放大机制以及基于G-四链体（G4）的比色检测方法，旨在提升对新兴传染病的预警能力，优化公共卫生响应，并推动基于污水的流行病学研究。

MPXV是一种由啮齿动物传播给人类的病毒，属于正痘病毒属，其基因组为双链DNA，长度约为200千碱基对。该病毒可以通过呼吸道飞沫、体液以及与感染者或动物的皮肤病变接触传播。尽管MPXV的临床表现通常比天花病毒更为温和，但其仍可能导致严重的并发症和死亡，尤其是在儿童和孕妇中。近年来，全球范围内猴痘疫情的爆发，使得研究者开始关注病毒在污水中的存在情况。研究表明，MPXV DNA可通过感染者的唾液、粪便和尿液等体液进入城市污水系统，这为流行病学监测提供了新的思路。

传统的临床诊断方法，如实时聚合酶链反应（PCR），虽然在检测灵敏度和特异性方面表现优异，但其依赖昂贵的热循环设备、复杂的操作流程和专业人员，因此难以在社区环境中实现快速、便携的现场检测。相比之下，基于污水的流行病学监测方法为公共卫生部门提供了一种更加经济、高效且具有广泛适用性的替代方案。该方法能够追踪病毒在人群中的传播范围和基因突变情况，甚至可用于检测其他病毒，如腺病毒和呼吸道合胞病毒。然而，目前的比色检测方法仍存在一定的局限性，尤其是在现场检测时，因环境干扰和复杂的污水成分，可能导致信号不稳定或检测结果不准确。

为解决这些问题，研究团队设计了一种新型的比色检测平台，名为hoRPA/SCas12a。该平台结合了heparin钠辅助的RPA/SCas12a反应机制和磷硫键修饰的发夹形G-四链体（psHG4）探针。在检测过程中，MPXV DNA会触发RPA扩增反应，随后激活SCas12a的非特异性DNase活性，从而切割psHG4探针的环状结构，释放出预阻断的psG4序列。释放出的psG4序列能够与hemin结合，形成G4/hemin复合物，进一步催化3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）的氧化反应，生成具有颜色特征的氧化产物（oxTMB）。通过智能手机记录溶液的红（R）、绿（G）和蓝（B）值的变化，即可实现对MPXV DNA的快速、灵敏检测。

该检测平台的性能表现优异，其检测范围覆盖10 aM至100 fM，最低检测限为3 aM，显示出极高的灵敏度。此外，该方法在城市污水中对MPXV DNA具有良好的选择性和准确性，能够有效排除其他干扰物质的影响。相比于传统的“信号-off”模式，该平台采用“信号-on”策略，使得检测信号更加稳定，减少了背景噪声对结果的干扰。这为现场快速检测提供了可靠的解决方案，特别是在缺乏专业设备和人员的环境中。

研究团队在构建该平台的过程中，对多种G-四链体结构进行了系统评估，以确定最适合用于比色检测的序列。通过实验，他们发现磷硫键修饰的G-四链体在激活的SCas12a系统中表现出更高的灵敏度和抗干扰能力。此外，研究还探讨了将gRNA拆分为两个独立组件（hRNA和sRNA）对SCas12a活性的影响。实验结果显示，这种拆分策略不会影响SCas12a的非特异性DNase活性，反而有助于提高检测效率和灵敏度。这一发现为后续的便携式检测技术提供了新的方向。

该平台的构建不仅依赖于分子生物学技术的创新，还结合了现代信息技术的应用。智能手机作为便携式设备，能够记录检测过程中的颜色变化，并通过图像处理软件进行数据分析。这种集成方式使得检测过程更加自动化和高效，同时降低了对专业设备的需求。此外，研究还考虑了实际应用中的环境因素，如金属离子和有机污染物对检测信号的干扰，并通过优化探针设计和反应条件，提高了检测的稳定性和准确性。

研究团队在实验过程中，采用了多种材料和试剂，包括TMB、BPA、PCB、链霉素、磷酸二氢钠、草甘膦、hemin等，这些试剂均为高纯度产品，确保了实验的可靠性。Cas12a蛋白及其反应缓冲液则来源于New England Biolabs（NEB），RPA试剂由ZC Bioscience提供，其他辅助试剂如二甲基亚砜、氯化镁和柠檬酸则来自中国国家化学试剂公司。这些材料的选用体现了对实验条件的严格把控，同时也为后续研究提供了标准化的试剂来源。

为了验证该平台的检测性能，研究团队进行了多次实验测试，并对结果进行了详细分析。实验结果表明，hoRPA/SCas12a平台在灵敏度、选择性和检测范围等方面均优于传统方法。此外，该平台在实际应用中展现出良好的稳定性和可重复性，能够在不同的污水样本中实现一致的检测效果。这些优势使得该技术有望成为未来公共卫生监测的重要工具，特别是在应对突发传染病时，能够提供快速、准确的预警信息。

该研究不仅为MPXV的检测提供了新的技术手段，也为其他病毒的检测研究提供了借鉴。随着全球范围内对传染病防控的关注不断加深，基于污水的流行病学监测方法逐渐成为研究热点。该平台的开发为这一领域带来了新的突破，其便携性和灵敏度使其能够广泛应用于社区、环境监测和公共卫生管理。此外，该技术还具有较高的扩展性，可以用于检测其他病毒，如新冠病毒（SARS-CoV-2）和呼吸道合胞病毒（RSV），为未来的病毒监测研究提供了更多可能性。

综上所述，这项研究通过整合RPA、SCas12a和比色检测技术，成功构建了一种适用于城市污水中MPXV DNA检测的便携式生物传感器。该平台不仅具有高灵敏度和准确性，还能够有效排除环境干扰，提高检测的可靠性。随着技术的不断优化和推广，该平台有望成为公共卫生部门在应对新兴传染病时的重要工具，为疾病的早期预警和快速响应提供有力支持。