基于偏振分辨技术的深紫外显微镜技术，可实现无标记成像，并显著提升细胞核与纤维结构的对比度

《Optical Materials: X》：Polarization resolved deep ultraviolet microscopy for label free imaging with enhanced nuclei and fiber contrast

本文提出了一种基于深紫外（265 nm）的偏振分辨显微镜，通过多角度成像捕获Stokes参数，结合自适应阈值技术解决像素错位问题，显著提升细胞核对比度和纤维结构分辨率，为无标记生物组织分析提供新方法。

　　深紫外（Deep Ultraviolet, DUV）显微技术是一种快速、无需标记的成像手段，在生物医学领域具有广泛的应用价值。与传统的可见光成像相比，DUV显微技术能够提供更高的空间分辨率，同时还能更有效地提取生物分子的定量信息，这对组织分析至关重要。此外，DUV光源的波长较短，能够增强细胞核的对比度，使其在细胞结构的观察中更加突出。近年来，随着高效率DUV发光二极管（LED）的出现，这种技术变得更加经济且实用。然而，当前DUV成像技术在应用过程中，往往忽略了光的偏振信息，而这些信息能够提供额外的结构洞察力。

在本研究中，我们提出了一种能够同时提取细胞核和纤维结构信息的偏振分辨深紫外显微镜。这种显微镜通过采集四组偏振图像，分别对应0°、45°、90°和135°的偏振方向，来计算组织介质的线性偏振参数。这种方法不仅能够增强细胞核的对比度，还能揭示纤维的取向信息，从而为组织结构的分析提供新的维度。为了克服多组图像之间可能存在的像素错位问题，我们采用自适应局部阈值技术，以确保提取的有效特征能够实现精确的图像配准。

在实验过程中，我们利用两个Glan-Laser偏振器来获取线性偏振信息。其中，一个偏振器位于样品平面的前方，用于生成线性偏振光；另一个偏振器则安装在一个电机驱动的旋转平台上，作为分析器，用于检测不同偏振方向下的信号。通过这种方式，我们能够获取更全面的偏振数据，包括线性偏振度（Degree of Linear Polarization, DoLP）和偏振角度（Angle of Polarization, AoP）。这些参数能够反映光在穿过组织样本时的偏振状态变化，为组织结构的分析提供新的依据。

我们采用的DUV光源为265 nm波长的LED（型号M265L4，Thorlabs），其特点是能够提供稳定的照明，并且在较低的电流下即可实现较高的输出功率。为了确保光束的准直性，我们使用了一个DUV透镜（型号L4052，Thorlabs），使得光线能够均匀地照射到样品上。随后，光线通过一个DUV敏感的sCMOS相机（型号PCO Edge 4.2UV，Excelitas）进行采集，该相机能够在较短的曝光时间内捕捉高质量的图像。我们设置每帧图像的曝光时间为200 ms，同时利用Kinesis软件（Thorlabs）控制偏振器的旋转，以确保四组图像的准确采集。每组图像的采集时间为12秒，而采集36组图像则需要约96秒。

在实验中，我们还测试了不同偏振状态下的光信号强度。通过对比可见光和DUV光的成像效果，我们发现DUV光在空间分辨率和对比度方面均优于可见光。例如，在分辨率测试中，我们使用了相同数值孔径的物镜：M Plan UV 50×/0.42（Mitutoyo）和M 20×/0.4（Nikon）。结果表明，在DUV照明下，系统能够分辨出分辨率靶标中的Group 10, Element 3，对应横向分辨率为390 nm。相比之下，可见光照明只能分辨出Group 9, Element 3，横向分辨率为780 nm。这一结果充分证明了DUV显微技术在空间分辨率方面的优势。

此外，我们还发现DUV偏振图像在对比度方面也优于可见光成像。我们归因于DUV光在穿过组织样本时与组织成分之间的相互作用更为显著，这种相互作用不仅能够增强细胞核的对比度，还能揭示纤维结构的取向信息。这种额外的偏振信息对于理解组织的微观结构具有重要意义，尤其是在肿瘤组织的研究中，纤维结构的取向和密度常常被用作诊断癌症早期和晚期阶段的重要指标。通过结合偏振分辨技术，我们能够更全面地分析组织的结构特征，从而为疾病的诊断和分级提供新的依据。

在医学应用方面，我们发现DUV显微技术在前列腺癌分级和中性粒细胞减少症的检测中表现出良好的性能。在前列腺癌的研究中，DUV光谱特征能够揭示内源性分子的分布情况，形成一种表型连续体，这种连续体能够提供独特的结构信息，并且具有纳米级的分辨率。这种表型连续体可以作为前列腺癌恶性程度的替代生物标志物，帮助识别具有侵袭性肿瘤的患者中的腺体表型变化。在中性粒细胞减少症的检测中，DUV显微技术能够实现对活体、未染色血液细胞的自动分割和分类，从而在短时间内区分中度和重度中性粒细胞减少症的患者与健康样本。

本研究中，我们采用的偏振分辨技术不仅能够提升成像质量，还能为组织结构的分析提供新的视角。传统的偏振成像技术通常依赖于偏振阵列相机，但这些设备在深紫外波段的灵敏度较低，因此在实际应用中存在一定的局限性。为了解决这一问题，我们采用两个Glan-Laser偏振器来获取线性偏振信息，这使得我们能够在不依赖昂贵设备的情况下实现高质量的偏振成像。此外，我们还优化了整个系统的光学设计，包括采用低光学损耗的隧穿结（Tunneling Junction, TJ）和介质层（SiO?插入层），以提高光的输出功率并降低系统的运行电压。

通过这些优化措施，我们成功实现了140.1 mW的输出功率，同时将系统的运行电压降低到当前报道的最低水平。这不仅提高了系统的效率，还使得DUV显微技术更加适用于临床和研究场景。此外，我们还测试了系统的光学通量，发现其约为0.22 μJ/cm2，这一数值在保证成像质量的同时，也避免了对组织样本的过度照射，从而减少了对样本的损伤。

在实际应用中，我们发现偏振分辨技术能够为生物医学研究提供重要的支持。例如，在肿瘤组织的研究中，纤维结构的取向信息能够帮助研究人员更好地理解组织的结构特征，从而为疾病的诊断和治疗提供新的思路。在肝纤维化的检测中，高维偏振参数成像能够有效量化组织的微观结构特征，这进一步证明了偏振分辨技术在医学诊断中的应用潜力。通过结合DUV成像和偏振分辨技术，我们能够实现对组织结构的更全面分析，为疾病的早期诊断和精准治疗提供新的工具。

为了确保系统的稳定性和可靠性，我们还对整个成像过程进行了详细的优化。例如，在图像采集过程中，我们采用了自适应局部阈值技术，以确保在不同偏振方向下的图像能够实现精确的配准。这一技术能够有效减少多组图像之间的像素错位问题，从而提高成像的准确性和一致性。此外，我们还对系统的光学参数进行了测试，包括光的输出功率、曝光时间、运行电压和光学通量，以确保系统能够在不同的实验条件下稳定运行。

通过这些测试和优化，我们发现DUV偏振显微镜在成像性能方面具有显著的优势。例如，在分辨率测试中，系统能够实现高达390 nm的横向分辨率，这在可见光成像中是难以达到的。此外，在对比度测试中，我们发现DUV偏振图像能够提供更高的对比度，这使得研究人员能够更清晰地观察组织结构的细节。通过这些改进，我们不仅提高了成像质量，还为生物医学研究提供了新的工具。

在实际应用中，我们发现DUV偏振显微镜能够为多种疾病提供有效的诊断手段。例如，在前列腺癌的检测中，DUV光谱特征能够揭示内源性分子的分布情况，从而为疾病的分级提供依据。在中性粒细胞减少症的检测中，DUV显微技术能够实现对活体、未染色血液细胞的自动分割和分类，从而在短时间内区分中度和重度中性粒细胞减少症的患者与健康样本。这些结果充分证明了DUV偏振显微镜在医学诊断中的应用潜力。

通过本研究，我们不仅开发了一种新型的偏振分辨深紫外显微镜，还验证了其在生物医学领域的应用价值。这种显微镜能够同时提取细胞核和纤维结构的信息，为组织结构的分析提供了新的维度。通过结合DUV成像和偏振分辨技术，我们能够实现对组织结构的更全面理解，从而为疾病的诊断和治疗提供新的思路。此外，我们还优化了系统的光学设计，使得DUV偏振显微镜在实际应用中更加高效和可靠。

总之，本研究的成果表明，偏振分辨深紫外显微镜在生物医学领域具有广泛的应用前景。通过结合DUV成像和偏振分辨技术，我们能够实现对组织结构的更全面分析，从而为疾病的诊断和治疗提供新的工具。同时，我们还验证了这种显微镜在提高成像质量、增强对比度和实现精确配准方面的优势，这为未来的医学研究和临床应用提供了重要的支持。