基于核黄素的光动力灭活技术用于抑制根霉菌（R. stolonifer）对蔬菜的侵害

《Postharvest Biology and Technology》：Riboflavin-based photodynamic inactivation against Rhizopus ( R. stolonifer) fungus for vegetables preservation

抗真菌光动力疗法中核黄素与EDTA协同效应及在樱桃番茄上的应用研究。通过体外实验证实，5mM EDTA与12.5-75μM核黄素结合UV-A辐射（1.70-20.4J/cm2）可有效抑制Rhizopus stolonifer生长，EC50随辐射剂量增加呈指数下降。体内实验显示双次处理（75μM核黄素+5mM EDTA+1.70J/cm2 UV-A）使番茄腐烂率降低100%，且未出现明显光毒性。该技术兼具安全性和环保性，为果蔬采后真菌防治提供新策略。

　　该研究聚焦于一种新型的光动力治疗方法，旨在有效控制一种名为“Rhizopus stolonifer”的真菌，这种真菌对多种蔬菜的储存造成严重损害，导致显著的经济损失。研究团队由Luis María Rodoni、Federico Martín Pintos、Silvina Larran、Carolina Lorente、Alejandra Inés Hevia和María Laura Lemoine组成，来自阿根廷拉普拉塔国立大学农业与林业科学学院的农业工业产品研究实验室。他们探讨了以核黄素（Rf）为光敏剂，结合电磁辐射的光动力治疗（aPDT）在控制真菌和减少可食用果实受损方面的潜力。

在研究过程中，研究人员将不同浓度的核黄素（0–75 μM）和乙二胺四乙酸（EDTA）添加到真菌孢子的培养基中，并在不同情况下暴露于紫外线A（UV-A）辐射（最大辐射剂量为20.4 J cm?2）。在22°C的条件下，持续监测了真菌的生长情况和黑色素含量，时间为6天。实验结果显示，单独使用核黄素对真菌的生长没有明显影响，无论是暴露于UV-A辐射还是未暴露。然而，EDTA表现出一定的抑菌效果，并抑制了真菌黑色素的生成。更进一步的发现是，当核黄素与EDTA联合使用并暴露于UV-A辐射时，能够显著减少真菌的生长，这表明了一种光动力作用。在果实实验中，樱桃番茄被接种了含有EDTA（5 mM）或核黄素（12.5或75 μM）的真菌孢子悬浮液，并暴露于0或1.70 J cm?2的UV-A辐射。结果表明，使用核黄素（75 μM）和EDTA（5 mM）的光动力治疗能够有效控制番茄的腐烂，两次连续处理能够完全防止果实腐烂。

该研究揭示了通过最优组合核黄素、EDTA和UV-A辐射控制“Rhizopus stolonifer”的关键技术参数。研究结果为开发防止采后腐烂和延长番茄货架寿命的策略提供了科学依据，同时展示了其在其他蔬菜上的潜在应用价值。这项技术不仅安全，而且对环境友好，有助于减少传统合成杀菌剂的使用，这些杀菌剂可能会对环境造成危害，并导致真菌抗药性的产生，同时还对人类健康构成风险。

“Rhizopus”是一类广泛分布于环境中的丝状真菌，属于粘菌门的广泛目，是导致多种高价值园艺产品（如葱属、茄属、菠萝蜜属、葫芦属、草莓属和番茄属）腐烂的主要原因之一，其造成的损失可达50%。该属真菌的一个显著特征是其孢子的广泛传播和持久性，这使得其成为采后腐烂控制中的一个重大挑战。通常，这类真菌感染会导致果实表面出现典型的白色菌丝“棉絮状”或软腐症状。在传统管理的作物中，常使用合成杀菌剂来控制“Rhizopus”及其他属的真菌。然而，随着社会对减少合成杀菌剂使用的呼声日益高涨，研究人员开始探索更安全和环保的替代方案。

清洗、消毒和漂洗是水果和蔬菜采后保存过程中几乎必不可少的步骤。然而，这些化学处理方法可能会对环境造成负面影响，并且其效果可能受限于田间真菌的初始负荷。此外，这些方法在某些情况下可能不够有效。因此，寻找一种既安全又有效的控制策略成为研究的重点。

光动力治疗（aPDT）作为一种替代传统方法，被提出用于防止收获后的果实变质。aPDT结合了电磁辐射、分子氧（O?）和一种名为光敏剂（PS）的化学物质。在某些情况下，PS吸收电磁辐射后变得活跃，生成活性物质如自由基和活性氧物种（ROS），从而在不损害宿主的情况下消除病原体。核黄素是一种天然存在的水溶性化合物，通常被认为是安全的，因为其过量部分可通过尿液排出。然而，核黄素在高温下相对稳定，但在暴露于太阳或人工电磁辐射下极易发生光降解。核黄素的吸收光谱显示其在UV-A（360 nm）和蓝光（440 nm）区域有两个吸收峰。在存在氧气的情况下，核黄素能够作为光敏剂，氧化如色氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、半胱氨酸和组氨酸等必需生物分子，以及脂质中的不饱和脂肪酸。因此，光动力反应可能会攻击微生物的活性成分。有趣的是，aPDT可能对不同目标造成非特异性损伤，因此其选择抗性微生物的能力较低。

本研究中，核黄素的光敏特性引起了广泛关注，因为其具有灭活人类病原体和治疗不同人类疾病的应用潜力。然而，关于aPDT对真菌有效性的信息相对较少。因此，本研究的主要目标是评估核黄素作为光敏剂对抗“Rhizopus stolonifer”的效果，并寻找一种有效的aPDT方法用于蔬菜的保存。

此外，考虑到以下几点：1）一些研究者在基于钠氯ophyllin的aPDT中加入了EDTA，以提高其对“Alternaria solani”、“Botrytis cinerea”和“Penicillium digitatum”等真菌的灭活效果；2）EDTA能够螯合钙离子，并且作为其他离子的竞争对手，干扰铁载体和锌载体，从而抑制“Penicillium digitatum”、“Penicillium italicum”和“Botrytis cinerea”等真菌的生长；3）EDTA（如同核黄素）也被认为对食品使用是安全且无害的。因此，本研究还旨在探索EDTA对“Rhizopus stolonifer”生长的影响，并评估其是否能增强基于核黄素的aPDT效果。

研究团队在本研究中展示了核黄素作为光敏剂在aPDT中的潜在应用，以一种安全且环保的方式控制采后真菌。研究的主要目标是明确影响核黄素作为光敏剂对抗“Rhizopus stolonifer”效率的关键因素。由于核黄素是一种安全的化学物质，将其用于aPDT可能为管理这种真菌以及可能导致果实和蔬菜采后损失的其他真菌提供一种环保的解决方案。

在实验方法部分，研究人员使用了多种化合物，包括核黄素、EDTA和氢氧化钠。他们配制了含有不同浓度核黄素的溶液，并在不同情况下测试了EDTA的效果。通过将孢子悬浮液接种在培养基中，并在不同条件下暴露于UV-A辐射，研究人员评估了不同浓度的核黄素和EDTA对真菌生长的影响。实验还涉及了不同时间点的生长监测和统计分析，以确定最佳的处理参数。此外，研究团队还测试了核黄素在不同浓度下的稳定性，以确保其在aPDT中的有效性。

在结果部分，研究发现，在无EDTA的情况下，核黄素对真菌的生长没有显著影响，无论是否暴露于UV-A辐射。然而，在EDTA存在的情况下，aPDT显示出显著的抑制效果。随着EDTA浓度的增加，真菌的生长率显著下降。在最高浓度EDTA（5 mM）和高剂量UV-A（20.4 J cm?2）的情况下，真菌的生长被减少至70–100%。此外，EDTA还显著减少了真菌的黑色素生成，这可能与其抑制真菌细胞壁结构和抑制光敏反应有关。

在果实实验中，樱桃番茄被接种了含有EDTA或核黄素的真菌孢子悬浮液，并暴露于UV-A辐射。结果显示，使用核黄素（75 μM）和EDTA（5 mM）的光动力治疗能够有效控制番茄的腐烂，两次连续处理能够完全防止腐烂的发生。此外，该治疗方案的效率取决于核黄素的浓度和UV-A辐射的剂量，这表明这两个参数可以调整以优化处理效果。

在讨论部分，研究指出，尽管UV-A本身具有一定的抗真菌潜力，但其光动力特性在存在合适的光敏剂时得到了显著增强。同时，UV-A被认为是一种比UV-B和UV-C更安全的策略，因为这些短波紫外线可能会对健康产生直接的负面影响。此外，UV-A是太阳辐射的主要组成部分，因此可以作为一种低成本的辐射来源。

核黄素作为一种食品安全的化合物，近年来因其在改善蔬菜采后质量方面的潜力而受到关注。然而，其在对抗导致果实和蔬菜腐烂的微生物方面的效果尚未完全确立。研究发现，在某些情况下，核黄素能够减少微生物的生长，但其具体机制仍需进一步研究。EDTA的抗菌特性已有长期的研究，能够有效抑制细菌、酵母、真菌和阿米巴原虫的生长。在本研究中，EDTA表现出明显的抑菌效果，但单独使用时无法完全阻止真菌的生长。然而，当EDTA与核黄素结合并暴露于UV-A辐射时，光动力治疗的效果显著增强。

核黄素在UV和可见光下会发生光降解，其糖链会损失碳原子，主要降解产物是lumichrome，其在UV-A下的活性显著降低，溶剂性也比母体分子差。然而，研究发现EDTA能够有效防止核黄素的降解，从而提高光动力治疗的效果。因此，EDTA不仅能够减少真菌的黑色素生成，还能够通过提高核黄素的稳定性，增强其光动力作用。

在真菌生长过程中，黑色素的形成具有重要作用。黑色素是存在于细菌、真菌、植物和动物中的黑色聚合物，能够增强孢子、菌丝、菌丝体、菌核和子实体的细胞壁。研究发现，EDTA显著降低了真菌的黑色素水平，这可能与其螯合金属离子的能力有关，因为这些金属离子是黑色素合成酶（如酪氨酸酶和漆酶）的重要辅因子。此外，即使在无UV-A的情况下，核黄素的添加也能进一步减少黑色素的生成，这表明其可能通过其他机制影响真菌的生理过程。

黑色素被视为真菌对抗不同压力因素的抵抗因子，能够阻断自由基和UV辐射。因此，EDTA和核黄素的结合可能通过减少黑色素的形成，使真菌更容易受到光动力治疗的影响。在本研究中，观察到在无UV-A的条件下，EDTA的加入显著减少了真菌的生长，并且其抑菌效果在某些情况下优于单独使用核黄素。

在实际应用中，研究团队还测试了光动力治疗在番茄果实上的效果。他们发现，在番茄果实上进行两次光动力治疗能够有效控制真菌的生长，且不会对果实的质量产生负面影响。此外，光动力治疗在番茄果实上的效果与在体外实验中观察到的效果基本一致，这表明体外实验可以作为评估该技术有效性的有效方法。

研究团队还讨论了该技术在采前和采后的应用潜力。自然太阳辐射包含UV-A和可见光，这些光谱范围内的辐射可以激活核黄素和其他光敏剂。尽管太阳辐射的强度因地理位置和季节而异，但其UV-A部分的强度远高于实验中使用的UV-A辐射剂量。因此，实验中使用的辐射剂量可能在太阳辐射下仅需约16–50%的暴露时间，这表明该技术在自然条件下的应用潜力。此外，光动力治疗在果实表面的反射作用可能为未直接暴露于太阳辐射的果实提供保护。

值得注意的是，在体外实验中，真菌在含有EDTA的培养基中生长受限，而在果实实验中，尽管EDTA的加入减少了果实的损伤，但其抑菌效果不如体外实验中观察到的显著。这可能是因为在体外实验中，真菌需要在整个生长过程中与EDTA接触，而在果实实验中，真菌可能通过获取果实中的丰富营养而部分抵消EDTA的抑制作用。然而，该技术在果实上的效果仍显示出显著的潜力，特别是在与核黄素结合的情况下。

综上所述，该研究为控制“Rhizopus stolonifer”等真菌提供了新的证据，表明核黄素作为光敏剂在光动力治疗中具有重要作用。通过优化核黄素、EDTA和UV-A辐射的浓度和剂量，可以有效减少真菌的生长，从而延长果实的货架寿命。此外，该技术在食品保存中的应用具有广泛前景，因为它不仅安全环保，而且可以减少对传统杀菌剂的依赖。未来的研究可以进一步探索该技术在不同蔬菜和水果中的应用效果，以及在自然太阳辐射条件下的实际效果。该技术的简单性和低成本也使其成为一种值得进一步研究的微生物控制方法。