系统生物学方法揭示了采后Hericium erinaceus（一种蘑菇）褐变过程中的关键分子参与者：蛋白质组学和代谢组学的视角

《Postharvest Biology and Technology》：Systems biology approach reveals key molecular players in the browning of postharvest Hericium erinaceus: Proteomic and metabolomic perspectives

香菇褐变机制研究：整合生理、蛋白质组与代谢组学分析揭示苯丙烷类代谢途径关键调控蛋白及代谢物动态。

　　鲜蘑菇在采摘后容易发生褐变现象，这一过程对蘑菇的品质和储存期限产生严重影响。为了深入了解褐变的分子机制，本研究采用蛋白质组学和代谢组学相结合的方法，结合生理变化，分析了鲜蘑菇在采摘后的储存过程中相关蛋白表达和代谢物丰度的变化，旨在揭示蘑菇褐变的分子响应机制。研究发现，随着储存时间的延长，总酚类和黄酮类物质的含量逐渐下降，而与褐变相关的酶活性，如多酚氧化酶（PPO）、酪氨酸酶（tyrosinase）和漆酶（laccase）则显著增加。综合组学分析显示，差异表达蛋白和积累代谢物主要富集在与次生代谢物合成、苯丙氨酸代谢、色氨酸代谢、酪氨酸代谢以及泛醌和其他萜醌生物合成等通路中。这些代谢物丰度的变化受到蛋白质表达的调控，与褐变过程呈正相关。特别地，色素合成的前体物质，如L-酪氨酸、L-多巴和色胺，在酪氨酸酶、L-色氨酸脱羧酶和过氧化氢酶的作用下显著上调并积累。此外，第9天时，苯丙氨酸氨裂解酶（PAL）对L-苯丙氨酸的调控作用减弱，使得下游代谢物如酚酸和黄酮类物质的积累增加，这些物质在褐变过程中被用作底物。总体而言，这些发现为理解鲜蘑菇在储存过程中的褐变机制提供了新的视角，并为优化其保鲜技术奠定了理论基础。

蘑菇作为一种重要的食用和药用真菌，在许多国家，包括中国、波兰、法国、韩国和日本，具有广泛的应用价值。它富含多种生物活性物质，如多糖、萜类、肽和其他必需营养成分，因此受到消费者的青睐。鲜蘑菇以其椭圆形的形态和洁白的颜色而著称，其独特的风味和口感使其成为市场上的热门产品。然而，尽管近年来蘑菇的栽培技术得到了快速发展，但关于采摘后蘑菇生理和代谢机制的基础研究仍相对不足。在采摘后的1至3天内，蘑菇常会出现生理退化现象，这是影响其储存期限的主要因素之一。微生物污染、高水分含量、持续的呼吸作用以及未受保护的结构是导致蘑菇储存期短的主要原因。其中，快速表面褐变是影响蘑菇采摘后品质的最显著问题之一。因此，阐明蘑菇采摘后的褐变机制具有重要意义。

褐变是一种高度复杂的生化过程，主要由酚类代谢物的酶促氧化引起。通常情况下，褐变反应不会在完整的真菌组织中发生，因为细胞质中的酶与细胞器中的酚类底物被细胞结构隔开。然而，当受到生物或非生物胁迫时，细胞结构可能会发生解离，从而打破这种隔离，使得酶与底物相互作用并启动褐变反应。根据水果和蔬菜中由多酚氧化酶（PPOs）介导的酶促褐变的经典理论，酪氨酸酶和漆酶是导致棕色色素聚合的主要酶类。它们的底物特异性涵盖了酚类和其他芳香化合物。此外，苯丙氨酸氨裂解酶（PAL）在次生代谢物合成过程中起着关键作用，负责多种苯丙烷类化合物的合成，包括简单酚类、木质素、黄酮类和花青素。先前的研究推测，采摘后非生物胁迫引起的PAL上调会增强苯丙烷途径的代谢流量，从而导致如肉桂酸和香豆酸等酚类化合物的积累，加速褐变过程。此外，由于褐变可能由膜系统破坏引发，而酶促褐变是膜破裂后的相应结果，因此抗氧化酶如过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）的变化也引起了关注。本研究之前的工作已经确认了CAT、POD和PAL酶活性在蘑菇储存过程中的变化及其与品质劣化之间的潜在关联。

近年来，基于组学的方法被广泛应用于揭示采摘后食用真菌对非生物胁迫因素的复杂整体生物机制。其中，蛋白质组学提供了对细胞内蛋白表达的全面认识，而代谢组学则能够提供所有代谢物的定性和定量信息。迄今为止，蛋白质组学或代谢组学分析已被用于比较采摘后或加工过程中与品质属性相关的蛋白和代谢物的变化，包括灰树花（Coprinus comatus）、羊肚菌（Morchella sextelata）、鸡油菌（Flammulina filiformis）和双孢蘑菇（Agaricus bisporus）。然而，采用单一组学方法在全面阐明采摘后褐变机制方面存在一定的困难。因此，综合蛋白质组学和代谢组学分析被用于从多个角度理解采摘后食用真菌的生理变化。然而，关于采摘后蘑菇褐变的研究仍存在显著空白，且对褐变机制的综合研究报道较少。

因此，本研究整合了采摘后蘑菇的生理、蛋白质组学和代谢组学分析，旨在从多角度阐明蘑菇子实体变色的分子机制，并为解决采摘后蘑菇褐变问题提供理论基础。同时，本研究获得的信息也可作为研究其他食用真菌褐变过程的基础参考。通过综合分析，可以更全面地理解采摘后蘑菇的代谢变化及其对褐变的影响。

在实验材料和样品准备方面，本研究选取了统一大小、成熟度和外观的鲜蘑菇子实体，这些蘑菇来自陕西宝鸡的生力现代农业发展有限公司。所有蘑菇（每朵约150克±20克）被放入保鲜盒（尺寸为29×20×8厘米，每盒3个样本）中，并用聚乙烯膜密封，存放在15±0.5℃和85±5%相对湿度的条件下，储存9天。样品分别在第0、1、3、5、7和9天采集，用于生理分析。在第0天和第9天采样点，蘑菇样本被立即用液氮快速冷冻10-15分钟，随后在-80℃下保存，用于蛋白质组学和代谢组学分析。每个时间点均进行三次生物学重复，每次重复包括三个单独的蘑菇子实体。

在总酚类和黄酮类物质含量的测定方面，总酚类含量采用Folin-Ciocalteu方法进行定量分析。在750纳米波长下记录吸光度，以没食子酸作为校准标准，得到的回归方程为y = 1.036x - 0.0214，R2值为0.996。总黄酮类含量则采用Tan等（2021）改良的方法进行测定，反应混合物的吸光度在510纳米波长下记录，以芦丁作为标准曲线，定量方程为y = 9.176x - 0.5011，R2值为0.993。含量以每克干物质毫克数表示。

在褐变相关酶活性的测定方面，多酚氧化酶（PPO，EC 1.10.3.2）活性的测定采用了Nasiri等（2019）的方法。简而言之，使用50 mM醋酸缓冲液（pH 5.5）提取酶，随后将上清液与50 mM L-儿茶酚孵育，通过在410纳米波长下测量吸光度来定量PPO活性。酪氨酸酶（EC 1.14.18.1）活性的分析则依据Fattahifar等（2018）提出的方法。具体步骤包括将样品在20 mM磷酸缓冲液中研磨，离心15分钟，得到粗酶液。酶反应系统由1 mL粗酶液、2 mL 10 mM L-DOPA和2 mL磷酸缓冲液组成。通过测量475纳米波长下的吸光度变化来评估酪氨酸酶活性。漆酶活性（EC 1.10.3.2）的测定则依据Hua等（2018）的方法。样品用10 mM醋酸缓冲液处理并研磨，随后离心。得到的上清液与醋酸缓冲液和1 mM ABTS混合，吸光度在420纳米波长下每30秒记录一次。酶活性以每毫克蛋白质单位数（U mg?1）表示。

在蛋白质组学分析方面，首先进行蛋白质提取和酶解。蛋白质提取采用乙醇沉淀法，具体步骤参照Zhang等（2023）的方法。简而言之，蘑菇样品在液氮中冷冻粉碎后，用裂解缓冲液进行匀浆。通过离心后得到的蛋白质溶液加入4倍体积的冰冷乙醇，过夜沉淀后溶解于8 M尿素中。蛋白质浓度通过BCA试剂盒进行测定。随后，等量的蛋白质进行胰蛋白酶酶解。上清液依次用DTT还原和IAM烷基化处理，离心后，将蛋白沉淀溶解于胰蛋白酶和碳酸氢铵中，于37℃下孵育过夜直至反应停止。之后，使用甲酸（0.1%，v/v）淬灭反应，肽进行脱盐处理，使用C18柱进行真空浓缩，并重新溶解于0.1%（v/v）甲酸中。

LC-MS/MS分析用于进一步研究蛋白质的分离和鉴定。使用Bruker Daltonics公司的纳米Elute UHPLC进行液相色谱分析，样品中的肽在40分钟内被分离，流速为0.3 μL/min，采用反相C18分析柱。流动相A由0.1%甲酸的水溶液组成，流动相B由84%乙腈和0.1%甲酸组成。梯度程序从2%流动相B开始，逐渐增加至22%持续25分钟，随后增加至35%持续5分钟，再增加至80%持续5分钟，最后在80%流动相下等度洗脱。在diaPASEF模式下进行数据采集，将毛细管电压调整至1500 V，以确保在m/z 100-1700范围内获取MS和MS/MS光谱。离子迁移率范围设定为0.85至1.3 Vs cm?2。碰撞能量从45 eV开始，随迁移率线性增加，同时动态选择20个最强烈的前体离子。

序列数据库搜索和定量分析使用DIA-NN（v1.8.1）进行，采用无库方法。Uniprot数据库（Proteome ID: UP000298061）为基于深度学习的神经网络算法生成光谱库提供了参考。采用MBR选项构建光谱库，调整假发现率（FDR）阈值至1%（前体离子和蛋白层面）。差异表达蛋白（DEPs）的倍数变化（FC）计算为所有生物学重复中定量值的平均比值。通过Student's t检验对差异表达蛋白进行筛选，显著差异由P值（<0.05）和FC（比值>1.5或<0.67）确定。

在代谢组学分析方面，首先进行样品的制备和提取。代谢物的测定采用Yang等（2025）的方法，并进行适当修改。将蘑菇样品在液氮中冷冻粉碎后，称取至少50毫克粉末，转移至离心管中。随后加入1200 μL 80%（v/v）甲醇水溶液，混合后每30分钟涡旋30秒，重复六次。离心后收集上清液，过滤0.22 μm微孔膜，转移至注射瓶中，用于后续的UPLC-MS/MS分析。

代谢物检测使用UPLC-ESI-MS/MS系统和Tandem质谱系统（MS，Applied Biosystems 4500 Q TRAP，美国）进行。UPLC分析采用Agilent SB-C18柱。流动相A为含0.1%甲酸的超纯水溶液，流动相B为含84%乙腈和0.1%甲酸的有机溶液。样品分析采用梯度程序：在9分钟内将流动相A从95%线性梯度至5%，随后在1分钟内等度洗脱至5% A和95% B。接着，在1.1分钟内恢复初始条件（95% A和5% B），并在2.9分钟内保持。进样量为2 μL，流动相流速设定为0.35 mL/min。柱出口连接ESI-QTRAP-MS，ESI源参数如下：正离子和负离子模式下的离子喷雾电压分别为5500 V和-4500 V；源温度为550°C；离子源气体I、气体II和帘幕气体分别调整至50、60和25 psi。此外，每个组分追踪一组特定的多反应监测（MRM）离子对，对应于每个时间段内洗脱的代谢物。

代谢物的鉴定和多变量分析基于MWDB（Metware Database）中的MS/MS光谱信息。在分析过程中，排除了同位素信号、Na?、K?和NH4?离子的加合物以及来自较大分子量物质的碎片离子。代谢物的定量采用MRM模式，选择特征碎片离子。随后，对所有检测到的代谢物的峰面积进行整合，并对相同代谢物在所有样本中的整合峰面积进行归一化处理。多变量统计分析用于评估代谢组学数据，数据标准化处理采用单位方差缩放方法，利用R软件（v 4.2.2）进行无监督主成分分析（PCA）和有监督正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）。差异积累代谢物（DAMs）的筛选标准为VIP>1和绝对Log?FC≥1.0。

生物信息学分析用于预测差异表达蛋白（DEPs）的亚细胞定位和功能注释，分别使用CELLO和基因本体（GO）数据库。此外，利用KEGG数据库对DEPs和DAMs的富集通路进行分类和整理。KEGG分析结果显示，苯丙烷类化合物合成、色氨酸代谢、苯丙氨酸代谢、酪氨酸代谢、谷胱甘肽代谢和氨基酸合成等通路均受到DEPs和DAMs的显著调控。

在统计分析方面，生理参数数据以均值±标准差（SD）表示。统计分析采用SPSS（版本21.0）进行，显著性由t检验确定（P < 0.05）。数据可视化使用Origin 2021和Adobe Illustrator 22.0。组学数据分析包括层次聚类、火山图、桑基图、相关网络和加权蛋白共表达网络分析（WGCNA），均使用R编程语言完成。蛋白质-蛋白质相互作用网络分析使用Cytoscape 3.8进行，节点关系基于相互作用得分计算。

研究结果表明，随着储存时间的延长，蘑菇的褐变程度逐渐加深，第9天的褐变最为明显。总酚类和黄酮类物质的含量在初期略有上升，但随后迅速下降。虽然这两种酚类物质的含量变化趋势相似，但最终储存时总酚类含量比第0天减少了37.2%，而黄酮类含量减少了29.8%。与褐变相关的酶活性则呈现出逐渐上升的趋势，与酶促褐变的发展相一致。值得注意的是，PPO和酪氨酸酶活性在储存1天后显著增加，而漆酶活性在前3天相对稳定，随后在第5天迅速上升。与初始酶活性相比，储存9天后的PPO、酪氨酸酶和漆酶活性分别增加了7.9倍、2.7倍和2.4倍，表明酶促褐变在蘑菇中发生。

蛋白质组学分析显示，LC-MS/MS方法鉴定出25,703个独特的肽，对应于4519个不同的蛋白。这些蛋白在UniProt数据库（含11,000个序列）中进行搜索。检测到的肽主要分布在7-20个氨基酸范围内。通过PCA分析评估样本组间的变异，结果显示，三个重复样本在组内表现出高度的可重复性，蛋白组内的蛋白变化较小。相比之下，不同储存时间点的样本分离度更大，表明储存时间显著影响蛋白表达，而同一组内的蛋白表达保持一致。为了评估储存时间对蛋白表达的影响，筛选差异表达蛋白（DEPs）的阈值设定为P值≤0.05，FC>1.5表示显著上调，FC<0.67表示显著下调。火山图展示了DEPs的分布模式，结果显示，第0天与第9天之间共有1392个蛋白表现出差异表达，其中544个蛋白上调，848个蛋白下调。热图分析进一步验证了DEPs在储存时间上的显著变化，颜色梯度从绿色到红色表示蛋白丰度的增加。

代谢组学分析表明，LC-MS方法揭示了不同储存时间点之间代谢物的显著变化。通过质量控制（QC）评估，包括混合QC样本的总离子流（TIC）和MRM色谱图（图S4A-D），显示出高光谱重叠度，确认了仪器的稳定性和数据的可重复性。PCA分析显示，第0天和第9天的样本之间存在显著的差异，表明两种储存时间点的代谢物变化较大。进一步使用OPLS-DA分析样本，以更好地反映不同储存样本之间的变化，结果也显示两种样本组之间的差异更加明显。响应置换测试（RPT）验证了OPLS-DA模型的稳定性，排除了过拟合的可能，从而支持了后续分析的可靠性。这些结果确认了OPLS-DA作为预测模型在区分储存样本代谢差异中的有效性。

KEGG数据库用于对代谢物的注释和富集分析，揭示了DAMs在哪些生物通路中富集。在第0天与第9天的比较中，显著富集的通路包括色氨酸代谢、次生代谢物合成、苯甲酸降解、谷胱甘肽代谢、黄酮类降解、酪氨酸代谢等。这些通路的变化为理解蘑菇在储存过程中的褐变模式提供了重要的生物学信息。

在DEPs和DAMs的表达相关性和网络分析方面，通过分析两种组学数据中的共同通路，我们对与褐变相关的DEPs和DAMs进行了层次聚类热图分析（图5D）。结果表明，DEPs和DAMs的表达模式之间存在显著的正相关，尤其是在那些下调的蛋白和代谢物之间。为了进一步探讨这些相关性，我们构建了DEPs和DAMs之间的相互作用网络，根据相互作用强度和连接蛋白数量对节点关系进行排序（图5E）。通过具体的数据（见表S3），我们发现了一些关键蛋白节点，如YUCCA、ANS、4CL、PAL和NAD?，这些蛋白与DAMs之间表现出显著的相互作用。这些发现表明，DEPs在调控与褐变相关的代谢通路中发挥着重要作用。

在构建O2PLS模型以识别与褐变相关的关键DEPs和DAMs方面，O2PLS模型被用于预测分析，以揭示与褐变相关的候选蛋白或代谢物。根据模型的预测误差贡献分析（R2），代谢和蛋白数据分别解释了模型变异的91.8%和96.4%。相比之下，组学相关成分的R2值为84.9%和93%，表明模型构建良好。通过O2PLS模型的载荷图，我们确定了在储存9天时，与褐变显著相关的代谢物和蛋白，包括3-羟基肉桂酸、L-苯丙氨酸、肉桂酸、双香豆素、L-多巴、Sciadopitysin、2-氧吲哚-3-乙酸、3,4-二羟基苯甲酸、色胺和香豆酸。这些代谢物和蛋白在储存过程中的表达水平和丰度变化为褐变机制提供了新的视角。此外，O2PLS分析还构建了与褐变相关的调控网络，进一步揭示了关键蛋白和代谢物在褐变过程中的作用。

综上所述，本研究通过整合蛋白质组学和代谢组学分析，揭示了鲜蘑菇在采摘后储存过程中的褐变机制。具体而言，与褐变相关的酶活性增强导致总酚类和黄酮类物质的减少，从而可能促进褐变前体物质的积累。关键的差异表达蛋白和代谢物在次生代谢物合成、酪氨酸代谢和色氨酸代谢等通路中表现出显著的富集，这些通路对于褐变的发展至关重要。同时，关键酶的表达水平与代谢物的丰度保持一致，表明它们通过氧化交联反应在褐变过程中发挥重要作用。此外，O2PLS分析识别出了一些与褐变相关的枢纽蛋白和代谢物，这些可能成为解决采摘后蘑菇褐变问题的关键因素。整体而言，这些发现为理解采摘后生理变化与褐变之间的分子机制提供了基础，并为开发延缓蘑菇褐变的潜在保鲜技术提供了理论依据。未来的研究将集中在通过分子和遗传方法对鉴定出的核心蛋白进行功能验证，以确认其在褐变中的调控作用。