多价疫苗通过调控犬类肠道菌群诱导抗细粒棘球绦虫感染的免疫保护

《npj Vaccines》：Cocktail vaccine induces immunoprotection and modulates the fecal microbiota in dogs against Echinococcus granulosus infection

本研究针对细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)感染这一重要人畜共患病，开发了基于生物信息学筛选的两种鸡尾酒疫苗rEgENO&rEgSev&rEgCyc和rEgFABP1&rEgCaM&rEgSrp1。实验证明疫苗可显著降低犬类寄生虫负荷（分别达80.58%和47.92%），并发现Ligilactobacillus、Fusobacterium和Streptococcus等菌群与免疫保护显著相关，为通过疫苗-微生物组相互作用提升疫苗效果提供了新策略。

　　

在广袤的草原牧场和农牧交错地带，一种名为囊型包虫病(Cystic Echinococcosis, CE)的人畜共患疾病正悄然威胁着数百万人的健康。这种由细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)引起的寄生虫病，不仅导致畜牧业重大经济损失，更在流行区造成严重的公共卫生负担。世界卫生组织(WHO)已将其列入2021-2030年重点控制或消除的疾病名单。

当前控制犬类细粒棘球绦虫感染的主要手段是每月一次的吡喹酮驱虫方案，但这一策略面临着资源需求高、长期用药导致抗药性出现等挑战。随着对犬类黏膜免疫应答机制的深入理解，开发有效的犬用疫苗被认为是阻断疾病传播的关键策略。与羊、牛等中间宿主相比，犬类数量相对较少，使得犬类疫苗接种成为更具成本效益的控制方案。

然而，疫苗研发面临着重大的科学挑战。细粒棘球绦虫复杂的生命周期涉及多个宿主转换过程，使其进化出精妙的免疫逃避策略。传统的抗原筛选方法依赖动物感染模型，存在实验周期长、成本高、生物安全风险大等限制。此外，个体间疫苗保护效果的差异性也制约着群体免疫的建立。近年研究发现，肠道微生物组组成与疫苗应答存在显著相关性，但关于细粒棘球绦虫感染、微生物组动态与疫苗效果之间关系的研究尚属空白。

在这项发表于《npj Vaccines》的研究中，研究人员通过整合多组学数据与生物信息学方法，建立了创新的疫苗抗原发现平台。他们首先构建了细粒棘球绦虫成虫外泌体的全面蛋白质组数据库，结合转录组学和比较蛋白质组学分析，从1940个蛋白质中筛选出13个潜在疫苗候选抗原。通过抗原性预测和功能注释，最终优先选择了6个蛋白进行疫苗效果评估：rEgENO(烯醇酶)、rEgSev(severin蛋白)、rEgCyc(亲环素)、rEgFABP1(脂肪酸结合蛋白1)、rEgCaM(钙调蛋白)和rEgSrp1(丝氨酸蛋白酶抑制剂1)。

这些蛋白的选择基于其重要的生物学功能：EgENO不仅是寄生虫能量代谢的关键酶，还是成虫外泌体的主要成分，参与宿主免疫调节；体表定位的EgSev蛋白可能通过类似EgA31的机制促进寄生虫运动；EgCyc含有高免疫原性表位；EgFABP1作为脂质转运蛋白，对寄生虫生存至关重要；而EgCaM和EgSrp1则在寄生虫成熟和适应肠道微环境中发挥重要作用。

研究人员将上述蛋白分为两组鸡尾酒疫苗：rEgENO&rEgSev&rEgCyc和rEgFABP1&rEgCaM&rEgSrp1，并与Quil-A佐剂联合使用，在比格犬模型中评估疫苗效果。研究设计了完整的实验时间线，包括两次皮下免疫接种、寄生虫攻击感染以及多个时间点的样本采集，系统评估了疫苗的保护效果、免疫应答动态和肠道微生物组变化。

关键技术方法包括：1）基于生物信息学的多步骤抗原筛选流程，整合外泌体蛋白质组、转录组和比较蛋白质组学数据；2）重组蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达与纯化；3）犬类模型疫苗接种与寄生虫攻击实验，使用来自四川屠宰场自然感染绵羊肝脏的细粒棘球绦虫原头节(protoscoleces, PSCs)进行攻击；4）血清IgG和细胞因子水平的ELISA检测；5）肠道组织病理学分析；6）16S rRNA基因测序进行粪便微生物组分析。

疫苗诱导的免疫保护效果

疫苗接种后28天，解剖结果显示各组的保护效果存在显著差异。rEgFABP1&rEgCaM&rEgSrp1疫苗使寄生虫负荷降低了47.92%(p<0.01)，而rEgENO&rEgSev&rEgCyc疫苗表现出更优的保护效果，寄生虫负荷减少达80.58%(p<0.01)。此外，后一组疫苗还导致虫体节片数减少0.86个，体长和体宽分别减少24.85%(p<0.01)和22.11%(p<0.01)。

组织病理学评估

组织病理学分析表明疫苗接种在一定程度上保护了肠道组织免受细粒棘球绦虫感染引起的损伤。对照组犬只显示弥漫性黏膜水肿，而疫苗接种组总体上保持了更好的黏膜完整性。H&E染色显示对照组犬只绒毛结构明显破坏，包括寄生虫附着部位的免疫细胞浸润。疫苗接种犬只保持了良好的绒毛形态，寄生虫附着位点较少。PAS染色显示所有组别均有强烈的黏蛋白产生，值得注意的是，疫苗接种组杯状细胞密度升高，与寄生虫驱动的黏液过度分泌一致。

血清IgG和细胞因子动态

血清IgG分析显示疫苗组间存在不同的抗体动力学特征。rEgFABP1&rEgCaM&rEgSrp1组在D21达到高IgG滴度，但到D49时水平下降，个体间差异较大。而rEgENO&rEgSev&rEgCyc组表现出强劲的IgG应答，在D21达到峰值，并持续显著高于对照组(p<0.05)直至D49。该疫苗诱导的血清IgG持久性可持续至少6个月，可能有助于维持长期的免疫保护。

细胞因子分析显示，rEgFABP1&rEgCaM&rEgSrp1组在第二次免疫后D21出现混合的Th1/Th2应答，表现为IL-2、IL-4和IFN-γ同时上调(p<0.05)。寄生虫攻击后(D35)，IL-2、IL-4和IFN-γ水平显著下降(p<0.05)，表明宿主免疫应答受到抑制。而rEgENO&rEgSev&rEgCyc组表现出独特的免疫应答特征：D21时细胞因子水平无变化，但在攻击后D35出现明显的Th2偏向免疫，表现为IL-4和IL-10显著上调(p<0.05)，IL-2抑制至检测限以下，同时IFN-γ水平显著升高(p<0.05)，表明IFN-γ通路激活。

粪便微生物组组成的α多样性和β多样性分析

纵向α多样性分析显示，rEgENO&rEgSev&rEgCyc疫苗组犬只的微生物群落发生显著变化。Shannon和Chao1指数在第二次免疫后7天(D21)相对于基线(D0)显著增加(p<0.05)，表明疫苗介导的微生物多样性扩张。攻击后14天(D35)Shannon指数持续升高(p<0.05)，提示微生物组重塑可能有助于增强宿主免疫防御。相比之下，rEgFABP1&rEgCaM&rEgSrp1组犬只出现微生物组失调，Shannon指数在D21短暂升高后，攻击后持续下降，在D49显著降低(p<0.05)，而Chao1指数保持统计学不变。

β多样性分析显示，rEgENO&rEgSev&rEgCyc样本沿PC1和PC2坐标形成明显的疫苗介导聚类(ANOSIM: R=0.7636, p=0.001)。基于Bray-Curtis距离的主坐标分析(PCoA)显示PC1(32.36%)和PC2(19.39%)解释了总方差的51.75%，表明疫苗诱导的粪便微生物组组成发生动态变化。

疫苗接种或细粒棘球绦虫感染犬只粪便微生物组的变异性

纵向动态分析揭示了干预特异性的分类学改变。通过分析前10个核心细菌属，结合LEfSe分析，确定了三个关键类群——Ligilactobacillus(厚壁菌门)、Fusobacterium(梭杆菌门)和Streptococcus(厚壁菌门)——对疫苗接种和细粒棘球绦虫感染表现出不同的应答。

对照组中，细粒棘球绦虫定植后(D35)，Ligilactobacillus相对丰度增加33.98%(p=0.008)，Streptococcus增加7.87%(p=0.014)，而Fusobacterium下降9.46%(p=0.014)。相反，rEgENO&rEgSev&rEgCyc疫苗组表现出相反的调节趋势：Ligilactobacillus和Streptococcus丰度分别下降13.03%(p=0.008)和27.28%(p=0.008)，而Fusobacterium水平上升5.76%(p=0.007)。这些发现表明疫苗接种可能通过调节关键细菌类群的相对丰度来对抗细粒棘球绦虫诱导的微生物组失调。

疫苗诱导的免疫与粪便微生物组改变之间的联系

环境因子分析显示Ligilactobacillus、Fusobacterium和Streptococcus的相对丰度与宿主Th1/Th2细胞因子谱存在显著的动态共变。Mantel检验和冗余分析(RDA)确定IFN-γ是疫苗接种后微生物组重构的主要因子(Mantel's r=0.79, p=0.01)。IFN-γ与IL-4和IL-10呈强正相关，而与IL-2呈负相关。这些发现表明Th1/Th2平衡在协调时间微生物变化中起关键作用。RDA约束了24.42%的微生物组方差(RDA1: 17.60%, RDA2: 6.82%; p<0.001)，其中IFN-γ解释了最大比例的约束变异。

本研究首次全面表征了细粒棘球绦虫感染、粪便微生物组改变和疫苗介导免疫之间的相互作用，为理解疫苗应答变异性提供了新见解。实验验证证实细粒棘球绦虫感染驱动犬只粪便微生物组的明显重塑。与典型蠕虫感染促进α多样性不同，细粒棘球绦虫感染显著降低Shannon指数(p<0.05)，同时增加Ligilactobacillus和Streptococcus丰度，抑制Fusobacterium。这些微生物改变可能通过三种机制增强寄生虫生存：Ligilactobacillus通过调节树突状细胞-T细胞相互作用促进免疫逃避；Streptococcus富集可能通过调节代谢重编程维持寄生虫有利的微环境；而Fusobacterium的消耗与蛲虫病中观察到的模式相似，表明存在保守的蠕虫驱动免疫调节机制。

rEgENO&rEgSev&rEgCyc疫苗在本研究中表现出最高的减少细粒棘球绦虫负荷的效果，该疫苗包含来自成虫的丰富ES抗原，可能参与宿主-寄生虫相互作用。高效疫苗组与对照组的比较分析揭示了Ligilactobacillus、Fusobacterium和Streptococcus的相反模式。疫苗诱导的微生物组重塑被观察到影响细粒棘球绦虫定植，从而机制性地贡献于保护性免疫。值得注意的是，Ligilactobacillus、Fusobacterium和Streptococcus丰度的纵向变化与疫苗接种犬只中IL-4浓度呈正相关，支持Th2偏向免疫应答促进寄生虫清除和减轻肠道病理。同时，IFN-γ波动表现出微生物组依赖性关联，表明疫苗诱导的IFN-γ产生可能通过与微生物群落的相互作用维持长期保护。

该研究建立了可靠的生物信息学驱动的疫苗抗原发现框架，开发的鸡尾酒疫苗rEgENO&rEgSev&rEgCyc在两次免疫接种后实现了80.58%的虫负荷减少，比现有两剂疫苗提高约10%。该疫苗具有三大优势：两剂皮下方案在对高剂量原头节攻击中赋予增强保护，同时保持操作可行性；免疫后持续6个月的抗体水平支持半年一次的疫苗接种策略；与多房棘球绦虫同源抗原的高序列同源性(>98%)提示对两种绦虫的潜在交叉保护作用。研究还首次揭示了疫苗通过调节关键微生物类群（Ligilactobacillus、Fusobacterium和Streptococcus）对抗寄生虫诱导的微生物失调，并发现IFN-γ是疫苗诱导微生物重组的关键因子，为通过靶向微生物组提高疫苗效果提供了新思路。

这项研究不仅为包虫病控制提供了理论依据，也为优化疫苗设计提供了新的视角，特别是在理解疫苗-微生物组-免疫应答三方相互作用方面取得了重要突破，为未来开发更有效的寄生虫疫苗奠定了坚实基础。