双聚酮合酶基因AdPKS7/8功能验证揭示aldaulactone在胡萝卜- Alternaria dauci病理系统中的关键作用

《Scientific Reports》：Transformation of Alternaria dauci demonstrates the involvement of two polyketide synthase genes in aldaulactone production and fungal pathogenicity

本研究针对植物数量抗病性（QDR）机制不清及杀菌剂过度使用问题，研究人员通过首次建立Alternaria dauci遗传转化体系，成功敲除AdPKS7和AdPKS8基因，证实二者协同调控关键毒素aldaulactone的生物合成，并揭示该毒素在真菌致病性中的核心作用。该成果为理解植物-坏死营养型病原体互作的化学 warfare 提供了直接证据，对开发新型病害防控策略具有重要意义。

　　

在植物与病原体漫长的协同进化过程中，化学战（chemical warfare）扮演着至关重要的角色。对于由坏死营养型（necrotrophic）病原真菌引起的植物病害而言，病原菌分泌的毒素（phytotoxins）是突破植物防御体系的关键武器。然而，关于毒素如何参与植物数量抗病性（Quantitative Disease Resistance, QDR）的具体分子机制，科学界的认知仍相当有限。胡萝卜（Daucus carota）的叶枯病（Alternaria Leaf Blight, ALB）由其病原菌Alternaria dauci引起，是胡萝卜生产中最具破坏性的叶部病害。在该病理系统中，一种名为aldaulactone的新型毒素被鉴定为既是真菌致病性的关键因子，也是胡萝卜对该病原菌产生部分抗性的重要决定因素。前期生物信息学分析推测，一个次级代谢基因簇中的两个聚酮合酶（Polyketide Synthase, PKS）基因——AdPKS7和AdPKS8，很可能负责aldaulactone的生物合成。然而，这一假设亟需直接的基因功能实验予以验证。由于此前尚无Alternaria dauci成功遗传转化的报道，这项研究面临着技术上的空白与挑战。

为了攻克这一难题，由Romain Berruyer领导的研究团队在《Scientific Reports》上发表了他们的最新成果。他们旨在通过建立A. dauci的遗传转化体系，对AdPKS7和AdPKS8进行基因敲除（knock-out），从而在分子水平上明确这两个基因在aldaulactone生物合成中的功能，并进一步探究该毒素在真菌致病性中的作用，为深入理解胡萝卜-A. dauci互作中QDR的机制奠定基础。

研究人员主要运用了几项关键技术：首先，他们成功建立了A. dauci FRA001菌株的遗传转化体系，这是该研究的关键突破，涉及原生质体（protoplast）制备、通过双交叉PCR（double-joint PCR）构建基因敲除盒（cassette）以及同源重组（homologous recombination）等步骤；其次，利用高效液相色谱-紫外检测（HPLC-UV）技术分析了野生型（wild-type）和突变体菌株有机渗出物（organic exudates）中的aldaulactone产量；最后，通过在可控环境下对易感（H1基因型）和部分抗性（I2基因型）胡萝卜叶片进行离体接种实验，定量评估了各菌株的致病性，使用病情进展曲线下面积（Area Under the Disease Progression Curve, AUDPC）进行统计分析。

研究结果

A. dauci转化体系的成功建立与突变体分子鉴定

研究团队成功优化并建立了适用于A. dauci的遗传转化方法。他们发现A. dauci对潮霉素B（hygromycin B）的敏感性高于其近缘种A. brassicicola，因此将初始筛选培养基中的潮霉素浓度从12 μg·mL^-1调整为8 μg·mL^-1。通过靶向替换AdPKS7和AdPKS8基因中编码酮合酶（Ketosynthase, KS）和酰基转移酶（Acyltransferase, AT）结构域的必要区域，以及一个非编码区（作为对照），成功获得了五个独立的敲除突变体：AdPKS7△AT、AdPKS7△KS、AdPKS8△AT、AdPKS8△KS以及作为对照的△NC（非编码区敲除）。PCR分子鉴定证实了Hph（Hygromycin Phosphotransferase）基因的正确插入以及目标区域的缺失，标志着A. dauci遗传操作技术的首次成功实现。

突变体形态学特征分析

对获得的突变体进行形态学表征发现，所有五个突变体（包括△NC）的菌丝径向生长速率均略快于野生型FRA001，且菌落色素沉着更深（呈黑色）。更为显著的是，突变体的分生孢子（conidia）纵向隔膜（longitudinal septa）数量显著多于野生型，部分突变体孢子形态出现异常，如菌体弯曲或形成细胞团块。这些一致的形态变化提示，转化过程本身（如Hph基因的插入）可能对真菌的生理产生了普遍影响，因此后续致病性分析中，选择△NC突变体作为与PKS基因敲除突变体比较的基准更为合理。

HPLC-UV分析证实PKS突变体丧失aldaulactone生产能力

通过HPLC-UV分析各菌株的有机渗出物发现，在aldaulactone标准品出峰时间（18.5分钟）处，野生型FRA001和△NC突变体均显示出明显的吸收峰，且其紫外吸收图谱（特征吸收峰在196 nm和302 nm）与标准品一致。然而，所有四个AdPKS7或AdPKS8敲除突变体（AdPKS7△AT, AdPKS7△KS, AdPKS8△AT, AdPKS8△KS）在该保留时间处均未检测到相应的峰值。这一结果提供了确凿的证据，表明AdPKS7和AdPKS8是aldaulactone生物合成所必需的，敲除其中任何一个基因都会导致该毒素的合成完全中止。

胡萝卜离体接种试验揭示aldaulactone在致病性中的关键作用

离体叶片接种试验结果表明，在易感的H1胡萝卜基因型上，△NC突变体（能产生aldaulactone）的致病性显著高于所有四个PKS敲除突变体（不能产生aldaulactone），而△NC与野生型FRA001之间的致病性无显著差异。这表明aldaulactone的产生对A. dauci在易感胡萝卜上的致病性至关重要。在部分抗性的I2胡萝卜基因型上，接种所有菌株（包括野生型、△NC和PKS突变体）后引发的病害严重度均较低，且彼此间无显著差异。这与之前发现的I2胡萝卜细胞对aldaulactone具有较强抗性相一致，说明对于I2基因型，aldaulactone的存在与否并不显著影响最终的病害表现，其部分抗性可能主要针对该毒素以外的其他致病因子。

研究结论与意义

本研究首次成功建立了Alternaria dauci的靶向基因敲除技术，填补了该物种遗传操作领域的空白。通过功能验证，直接证明了AdPKS7和AdPKS8两个聚酮合酶基因共同负责关键毒素aldaulactone的生物合成。更为重要的是，研究明确了aldaulactone是A. dauci在易感胡萝卜上致病性的主要决定因子，其缺失会显著降低病害严重度。这些发现将毒素生物合成、真菌致病性和植物部分抗性三者紧密联系起来，为理解胡萝卜-A. dauci病理系统中数量抗病性（QDR）的机制提供了分子基础。

与某些病原菌（如Botrytis cinerea）中致病因子存在功能冗余（functional redundancy）不同，本研究表明aldaulactone在A. dauci致病过程中具有不可替代的核心作用。根据其广谱的细胞毒性以及A. dauci较宽的寄主范围，aldaulactone很可能属于非寄主专化性毒素（Non-Host-Specific Toxin, NHST）。因此，胡萝卜对aldaulactone的抗性机制可能涉及复杂的、由多基因控制的解毒或细胞防御途径，而非单一的主效抗病基因（R-gene），这符合QDR的一般特征。

该研究不仅深化了对特定植物-病原体互作系统的认识，其建立的遗传转化方法也为后续深入研究A. dauci的其他致病相关基因提供了强大工具。未来，揭示aldaulactone的分子作用靶点以及胡萝卜相应的抗性机制，将有助于开发新的病害防控策略，减少对化学农药的依赖，对于推动可持续农业的发展具有潜在的重要意义。