基于高分辨率熔解分析的实时PCR平台优化及其在疟原虫物种精准诊断中的应用研究

《Scientific Reports》：Optimization of the real-time PCR platform method using high-resolution melting analysis and comparison with sequencing and phylogenetic analysis for developing optimal malaria diagnostic methods

本研究针对疟疾诊断中传统镜检法灵敏度低、分子检测成本高的难题，开发了一种基于高分辨率熔解（HRM）分析的实时PCR检测技术。研究人员通过优化18S SSU rRNA靶向引物，实现了对恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）和间日疟原虫（Plasmodium vivax）的快速鉴别，熔解温度差异达2.73°C。与测序结果对比显示HRM技术具有100%灵敏度和99.31%特异性，为资源有限地区提供了一种高精度、低成本的疟疾诊断方案。

　　

在发展中国家，疟疾依然是严重威胁公共卫生的传染病。据世界卫生组织统计，全球每年约有2.29亿疟疾病例，其中五岁以下儿童和孕妇面临最高风险。疟原虫感染可引起从无症状携带到严重急性感染的一系列临床表现，特别是恶性疟原虫和间日疟原虫感染可在人体内持续数月甚至数年。准确识别疟原虫物种对于降低感染率至关重要，但现有诊断方法仍面临诸多挑战。

传统的光学显微镜检查吉姆萨染色血涂片虽被视为疟疾诊断的"金标准"，能进行虫种鉴定、寄生虫发育阶段评估和形态学分析，但其灵敏度有限，仅能检测每微升血液中10-50个寄生虫，对无症状或低密度感染的识别能力不足。虽然巢式PCR、实时定量PCR等分子方法具有更高灵敏度，能检测低至0.02寄生虫/μL的感染密度，但这些技术成本高昂且需要专业设备，在资源有限地区的推广应用受到限制。

在此背景下，高分辨率熔解分析技术因其快速、闭管操作和成本效益高的特点，为疟原虫物种鉴定提供了新思路。该技术通过分析扩增DNA靶标的熔解温度曲线差异来区分不同物种，在单核苷酸多态性检测和病原体物种鉴别方面展现出巨大潜力。然而，HRM技术在疟疾研究和诊断中的应用仍未充分开发。

为应对这一挑战，研究人员开展了一项旨在优化基于HRM分析的实时PCR平台方法的研究，并将结果与测序和系统发育分析进行比较，以开发最优的疟疾诊断方案。研究团队在伊朗东南部的锡斯坦和俾路支斯坦省多个地区收集了300份有疟疾疑似症状患者的样本，通过系统性方法评估HRM技术在疟疾诊断中的实际应用价值。

研究采用了几项关键技术方法：首先从300份临床样本中提取基因组DNA；接着通过针对18S SSU rRNA保守区域的PCR扩增和巢式PCR进行初步筛查；然后利用自行设计的引物开展实时PCR结合HRM分析，在LightCycler? 96仪器上生成熔解曲线；最后对阳性样本进行双向测序和系统发育分析验证结果。所有技术方法均通过三组重复实验确保可重复性。

靶向区域和引物设计

研究人员针对18S SSU rRNA保守区域，使用正向引物MEH和新设计的反向引物Omid进行HRM分析。Blast分析表明，扩增子覆盖区域小于200个碱基对，有利于在熔解曲线分析中区分疟原虫物种。通过选择60°C的最佳退火温度，确保了HRM分析的特异性。为支持HRM引物设计，团队对从GenBank检索的保守18S SSU rRNA基因序列进行了计算机分析，这些序列的预测熔解温度为指导选择合适的引物靶点和预期HRM图谱提供了依据。

熔解温度

HRM分析成功基于独特的熔解曲线（衍生曲线、对齐曲线和差异图）识别了疟原虫物种。确定的熔解温度分别为：间日疟原虫79.02°C、恶性疟原虫77.88°C、疟疾疟原虫77.68°C和卵形疟原虫80.16°C。这些发现与表4中的计算机预测一致，支持了针对该区域进行物种区分的有效性。

HRM分析的灵敏度和特异性

使用MEH-F和Omid-R引物的HRM分析显示出高特异性，与物种特异性对照质粒相关性良好。循环阈值变化表明PCR扩增成功。该方法有效区分了间日疟原虫和恶性疟原虫，与刚地弓形虫物种显示轻微相似性。计算机分析中观察到的疟原虫引物与刚地弓形虫序列之间的微小相似性可以忽略不计，实验运行中未观察到交叉反应，证实了分析的高特异性。

熔解温度、标准差和变异系数的估计

Tm值分析显示恶性疟原虫和间日疟原虫之间存在2.73°C的差异，凸显了HRM在物种鉴定中的区分能力。物种区分基于特征性Tm值，种间差异≥1.5°C被认为足以进行清晰区分。这些阈值是通过分析对照和测序确认的样本确定的。

与测序和巢式PCR的比较

在分子分析之前，所有300份外周血样本均首先以显微镜检查作为金标准进行初步筛查。然而，由于显微镜对低寄生虫血症感染的灵敏度有限，采用PCR方法进行确认和物种鉴定。在300份样本中，仅有29份通过至少一种分子方法呈阳性。具体而言，巢式PCR检测到20例间日疟原虫和9例恶性疟原虫，而HRM检测到14例间日疟原虫和15例恶性疟原虫。两种方法均未观察到疟疾疟原虫、卵形疟原虫或混合感染。尽管HRM对恶性疟原虫表现出高性能，但其检测间日疟原虫的灵敏度略低，巢式PCR鉴定出的6份间日疟原虫阳性样本未被HRM检测到。这种差异可能源于无症状个体中寄生虫密度低、对间日疟原虫的扩增效率降低或靶区域内序列变异。与作为参考标准的测序相比，HRM显示出100%的灵敏度和99.31%的特异性，超过了巢式PCR，特别是在快速检测急性疟疾病例方面。方法之间的差异可能归因于灵敏度阈值和模板可用性的不同。

系统发育分析

测序确认了间日疟原虫和恶性疟原虫的身份，通过凝胶电泳验证了扩增子大小。比对揭示了两物种中的插入突变和单核苷酸变化。为了评估HRM分析的分析灵敏度和可重复性，对确认疟原虫样本的系列稀释DNA进行了PCR-HRM检测。在整个稀释系列中获得了清晰的扩增和物种特异性熔解曲线，表明该方法可以可靠地检测低DNA浓度而不会丧失物种区分能力。

与NCBI数据库的比较

测序样本与NCBI数据库条目表现出高度相似性，确认了物种鉴定。使用最大似然法进行的系统发育分析将来自锡斯坦和俾路支斯坦省的分离株与全球疟原虫物种进行了比对。系统发育树显示，研究的分离株与地区的间日疟原虫和恶性疟原虫分离株亲缘关系最近。树的簇结构也证实了物种确定的准确性。

研究结论和讨论部分强调了优化HRM方法的重要意义。恶性疟原虫和间日疟原虫之间熔解点2.73°C的温度差异是本研究的关键发现，显示了优化HRM技术的强大能力。实验熔解温度与计算机预测的一致性强调了HRM引物设计的稳健性。HRM提供了具有高重复性的物种特异性Tm值，这在表5中观察到的低种内变异得到了反映。

在锡斯坦和俾路支斯坦省等恶性疟原虫和间日疟原虫共存的地区，快速准确识别恶性疟原虫至关重要，因为其可能引发严重和致命的疟疾。HRM方法在大约2-3小时内提供结果，比巢式PCR更快，与实时PCR相当，且准确性更高。HRM能够检测到巢式PCR阴性的额外恶性疟原虫病例，突显了其在检测低寄生虫血症感染方面的卓越灵敏度。这对个体患者管理和更广泛的公共卫生倡议都具有重要意义。

与测序方法相比，HRM在准确性和物种鉴定方面与测序方法表现出极好的一致性，且不存在测序的表达性和复杂性问题，在资源有限地区可能是合适的替代方案。与巢式PCR相比，HRM由于其闭管系统最大限度地降低了污染风险，可能比巢式PCR更快速、更具成本效益，且具有更好的灵敏度和特异性。

尽管结果令人鼓舞，但研究也存在一些局限性：阳性样本数量有限可能影响HRM性能结果的普适性；样本局限于特定地理区域可能影响结果的普遍性；研究未考虑较不常见物种如疟疾疟原虫或卵形疟原虫；尽管未在样本中识别出混合感染，但未包含加标或模拟共感染对照来评估HRM方法检测混合物种的能力。

综上所述，优化的HRM方法可靠，且由于其闭管格式和简化的工作流程，可能比巢式PCR更快速、更具成本效益。与测序相比，HRM的可靠性能验证了其准确性，其操作优势使其更适合常规使用。在疟疾管理中准确性、周转时间和可及性至关重要的情况下，HRM可能为改进诊断提供有价值的补充工具，特别是在资源有限的环境中。